GSTZ1通过下调TGF-β信号通路抑制肝癌细胞侵袭和转移的机制研究

作     者：雷冲 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐霓

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 谷胱甘肽S-转移酶ζ TGF-β信号通路 迁移和侵袭 上皮间质转化 

摘      要：目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第6大恶性肿瘤,其高转移率是导致HCC病人高死亡率的一个重要原因,因此深入探索其转移的分子机制对于肝细胞癌的诊断和治疗意义重大。有研究表明高酪氨酸血症（Hereditary tyrosinemia,HT1）,肥胖,糖尿病以及肝脂肪变性更易进展为HCC,表明代谢因素是肝细胞癌发生发展的一大病因。谷胱甘肽S-转移酶Zeta 1-1（Glutathione Stransferase Zeta 1-1,GSTZ1-1）,属于GSTs超家族的一员,参与苯丙氨酸分解代谢和异源物质解毒。课题组前期研究发现GSTZ1缺失能够促进肝癌细胞增殖,抑制其凋亡[1,2]。为进一步探索GSTZ1在HCC中扮演的生物学作用,我们发现GSTZ1可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,RNA-Seq测序分析结果表明过表达GSTZ1能显著下调TGF-β信号通路,且该通路位于受GSTZ1影响的信号调控网络的中心位置,是驱动肝细胞癌侵袭和转移的核心调控信号之一。上述发现表明GSTZ1可能与肝细胞癌的迁移和侵袭有联系。本课题的目的在于明确GSTZ1与肝细胞癌迁移和侵袭的关系,并探索可能的分子机制。方法:1.在Huh7,SK-Hep1以及SNU449细胞模型中,用划痕实验和Transwell实验探索过表达或者敲除GSTZ1后对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的影响2.分别在上述细胞模型中,采用q RT-PCR,Western Blot分别检测GSTZ1对肝癌细胞EMT相关标志物m RNA以及蛋白表达水平的影响,使用激光共聚焦显微镜检测GSTZ1对肝癌细胞Vimentin,N-cadherin,Fibronection蛋白表达量的影响。3.分别在上述细胞模型中,采用双荧光素酶活性实验,胞浆和胞核实验,Western Blot以及激光共聚焦显微镜检测GSTZ1对TGF-β信号通路的调控作用。4.在GSTZ1敲除细胞模型中,通过转染质粒敲低细胞内Smad2蛋白表达,或者采用TGF-β信号通路抑制剂SB431542处理,观察干预TGF-β信号通路后,肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变,以及Vimentin和Fibronection蛋白表达量的改变。5.在临床肝癌和癌旁组织标本中,采用Western Blot检测肝癌和癌旁组织中GSTZ1与p-smad2/3蛋白表达情况。6.通过尾静脉注射建立肝癌肺转移的裸鼠动物模型,观察GSTZ1对肝癌细胞肺转移能力的影响。结果:细胞功能学实验结果显示过表达GSTZ1抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。q RT-PCR,Western Blot以及激光共聚焦实验结果表明GSTZ1能够下调Vimentin,Fibronection以及N-cadherin的表达,从而抑制肝癌细胞的上皮间质转化。荧光素酶,胞浆胞核分布以及Western Blot实验表明GSTZ1能抑制Smad2/3的核转位以及pSmad2/3的表达。采用shsmad2,或者TGF-βR1抑制剂SB431542干预TGF-β信号通路后,能逆转由于GSTZ1缺失而增强的肝癌细胞迁移和侵袭能力以及上皮间质转化。在体内实验中,我们进一步分析了临床肝癌与癌旁组织中GSTZ1和p-Smad2/3的表达情况,发现GSTZ1在肝癌与癌旁组织的表达与p-smad2/3呈现负相关性。在裸鼠肺转移模型中,我们发现GSTZ1能抑制肝癌细胞的肺转移能力。结论:我们在细胞、裸鼠以及临床肝癌组织标本中首次发现GSTZ1通过下调TGF-β信号通路从而抑制肝癌细胞侵袭,迁移和上皮间质转化。本研究丰富了肝癌发生发展的分子机制,为肝癌的诊断和治疗提供了参考。