真菌毒素玉米赤霉烯酮降解酶基因资源挖掘及其催化效率分子改良研究

作     者：于心蕊 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：柏映国

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：玉米赤霉烯酮降解酶 内酯水解酶 基因挖掘 分子改良 融合表达 

摘      要：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌产生的类雌激素样真菌毒素,不仅损伤动物的肝肾,降低免疫机能,而且影响动物的生殖性能,给牲畜养殖业及食品安全带来了严重的危害。内酯水解酶可以高效、环保的方式去除饲料中的霉菌毒素ZEN,有效助力畜牧行业绿色健康养殖。本研究旨在获得可高效水解ZEN的酶,研究其生化特性以及催化机理,探索高效表达方案,推进其在畜牧养殖业的应用。为了进一步挖掘可高效水解ZEN的酶基因资源,以具有ZEN水解活性的内酯水解酶ZHD101的氨基酸序列出发,在NCBI数据库进行检索分析,获得了18个一致性较低的潜在ZEN水解酶基因序列,并通过在毕赤酵母中异源表达进行活性筛选。结果表明:所有基因均实现了异源表达,5个检测到明显活性。其中,来源于Phialophora americana的假想蛋白ZHD607对ZEN的降解效率高达100%,比活达到4940 U/mg。为了进一步研究其催化机理,本研究选取了与ZHD607一致性较高(74%)的内酯水解酶RmZHD为对比材料。RmZHD具有更高的比活性(12,288 U/mg),是ZHD607的2.5倍。通过对ZHD607进行同源建模并与RmZHD的晶体及序列比对分析,寻找与底物结合的关键氨基酸区段及位点,设计了8个突变体。结果表明:突变体ZHDM1(14,419 U/mg)和I160Y(16,652 U/mg)催化效率相较于野生型显著提高,分别为野生型的2.9倍和3.4倍。进一步通过分子动力学模拟分析其催化效率提高的机制,突变后160位点侧链的变化以及loop 136-142上Pro135和Leu138残基的侧链扭转可以显著增强与底物之间的疏水相互作用,进而提高了酶与底物的结合能力。表达量低一直是制约内酯水解酶推广应用的瓶颈问题。本研究基于融合表达策略分别将来源于Aspergillus niger的酸性木聚糖酶XYNB和Bacillus sp.的碱性木聚糖酶A11与ZHD101在毕赤酵母X33中进行高效表达。相较于单独表达的ZHD101,融合蛋白XYNB+ZHD101的ZEN水解活性活性提高了1.2倍,诱导48 h后的酶活可达983.77 U/mL。qPCR以及比活力测定结果与SDS-PAGE分析一致,说明融合表达可以显著提高ZHD101的蛋白表达量。此外,融合蛋白XYNB+ZHD101中的木聚糖酶活性与ZEN水解活性呈显著的线性化关系,可在发酵过程中通过检测木聚糖酶的活性表征ZHD101的活性,为其大规模产业化生产奠定了基础。本研究以已报道晶体结构的具有ZEN水解活性的内酯水解酶ZHD101为研究背景,基于ZHD101的序列检索了新颖的ZEN水解酶基因,并获得了多个高活力的ZEN水解酶基因,丰富了ZHD家族成员;基于结构基础对ZHD607的催化效率进行分子改良研究,获得了两个活性显著提高的突变体,并阐释了其对ZEN高效水解的催化机理;基于融合表达的方式显著提高了ZHD101在毕赤酵母中的表达量,结合建立的间接酶活测定方法为工业化大规模生产提供了强有力的支持。