丙酮酸乙酯靶向胶质细胞介导髓鞘再生的探索

作     者：何燕 

作者单位：山西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖保国;马存根

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：丙酮酸乙酯 CPZ诱导脱髓鞘模型 髓鞘再生 小胶质细胞 星形胶质细胞 

摘      要：目的丙酮酸乙酯（Ethyl pyruvate EP）是内源性能量底物丙酮酸的衍生物,具有很强的抗炎和抗氧化作用。淫羊藿总黄酮（Total flavonoids of Epimedium TFE）是中药淫羊藿的提取物,但它们在髓鞘再生中的作用尚未被探索。在这项研究中,EP有效改善双环己酮草酰二腙（Cuprizone,CPZ）诱导的脱髓鞘模型小鼠的行为学和组织学,EP治疗增强了小胶质细胞的髓鞘碎片吞噬功能。髓鞘脱失伴随明显的小胶质细胞活化和神经炎症。EP可诱导炎性M1小胶质细胞向抗炎的M2小胶质细胞极化,表现为iNOS/TNF-α降低,Arg-1/IL-10升高。此外,EP还降低了小胶质细胞的炎性分子TLR4/p-NF-kB/p65的表达和IL-1β及IL-6的分泌,从而抑制了小胶质细胞介导的神经炎症。星形胶质细胞在髓鞘脱失和髓鞘再生过程中也具有极其重要的作用,由此可能成为治疗脱髓鞘病变的潜在靶点。在EP治疗改善小鼠的行为异常和髓鞘脱失的基础上,我们进一步探讨EP对星形胶质细胞功能的影响,特别是对星形胶质细胞向少突胶质细胞分化的影响。结果表明,EP可增加星形胶质细胞在髓鞘中的积累,促进星形胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬。同时,EP可诱导星形胶质细胞上调胼胝体和纹状体中CNTF和BDNF的表达,同时增加转译因子nestin、Sox2和β-catenin的表达,降低星形胶质细胞Notch1的表达。由于星形胶质细胞来源的CNTF和BDNF有助促进少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的动员和形成。我们发现EP能有效促进NG2和PDGF Ra+OPCs的生成,部分细胞可表达成熟星形胶质细胞标志物GFAP。通过脑内注射荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的原代星形胶质细胞,我们进一步证实EP治疗后,在胼胝体区域可见移植入脑的CFSE标记星形胶质细胞可表达Sox2和NG2,提示EP可能将星形胶质细胞转分化为髓鞘细胞。我们的研究结果表明,在髓鞘脱失的病理过程中,EP干预可同时作用小胶质细胞和星形胶质细胞,构建一个有利于髓鞘再生的微环境,促进髓鞘的再生,显示有临床的进一步探索和应用的前景。临床上,中西药联用的情况非常普遍。中西药联用难免会发生某种药物的相互作用,可能产生协同增效的效果,也可能引起药品不良反应。其后果可能有助于疾病的改善,也可能造成组织器官损害,加重疾病的进程。基于我们前期TFE对髓鞘的保护和髓鞘再生的研究,在本课题中,我们试图将EP联合TFE以不同的比例组合,二者相加后的剂量与单一EP和TFE剂量相同,比较其对小胶质细胞的氧化物清除能力和抗氧化效率。同时,比较其对星形胶质细胞生长因子分泌的影响,为今后临床中西医药联用的选择提供实验依据。结果显示,EP与TFE在特定比例条件下（1:1）,能更有效清除氧化产物;抑制小胶质细胞产生NO;诱导星形胶质细胞表达CNTF和bFGF。方法本实验采用6周龄C57/BL6雄性小鼠,建立CPZ诱导的C57/BL6小鼠脱髓鞘模型。小鼠分为正常组、正常+EP组、模型组、EP治疗组。正常组和正常+EP组小鼠正常饲料饲育6周,模型组和EP治疗组小鼠用含0.2%CPZ的粉末饲料饲育6周。在喂食后的第四周末（第28天）开始,正常+EP组和EP治疗组腹腔注射EP,正常组和模型组腹腔注射生理盐水,每天一次连续注射2周至喂食后的第六周末（第42天）。动物实验结束前,对小鼠进行行为学测试,包括强迫游泳,高架十字迷宫,T迷宫,用于评估小鼠的抑郁,焦虑和认识障碍的状况。在第六周末处死动物,分别收集脑组织,制作冰冻切片和提取蛋白,前者用于免疫组化,后者用于蛋白印迹和ELISA。流式细胞术检测BV2小胶质细胞、原代小胶质细胞和星形胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬,细胞表型,细胞增值。脑立体定位注射观察用CFSE标记的标记星形胶质细胞在体内移行和分化的情况。各组实验数据应用GraphPad Prism 7.0统计软件进行统计分析。结果1.与以前的报道一致,与正常饮食的小鼠相比,小鼠的体重在第一周显著下降,并在随后的三周保持稳定,但体重减轻。CPZ组和CPZ+E组两组老鼠的体重没有显著差异。行为学测试显示,与正常喂食小鼠相比,CPZ喂食6周的小鼠表现出焦虑,抑郁和认知障碍。但是,EP治疗可有效改善上述异常行为（p0.05）。Black Gold II染色显示,与CPZ模型小鼠相比,EP治疗增加Black Gold II染色的强度,改善髓鞘的脱失（p0.05）。这些结果表明,饲喂CPZ的小鼠表现出明显的髓鞘脱失,同时伴有焦虑,抑郁和认知障碍异常行为。然而,在EP治疗可改善髓鞘脱失,同时改善CPZ模型小鼠异常行为学。***-1免疫荧光染色结果显示,与正常小鼠相比,CPZ喂食小鼠的胼胝体,纹状体和皮层中Iba-1+小胶质细胞富集,Iba-1+小