NUPR1基因对人多发性骨髓瘤细胞自噬及凋亡的影响及机制研究

作     者：黎安茂 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈建斌

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：多发性骨髓瘤 核蛋白1 PI3K/AKT/mTOR 自噬 凋亡 

摘      要：目的研究NUPR1基因及自噬标记物在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）患者骨髓的表达。构建慢病毒沉默NUPR1基因,转染MM细胞株,创新性探讨NUPR1基因对MM细胞自噬及凋亡的影响及机制。方法1.收集初诊MM患者骨髓标本28例,健康志愿者骨髓标本10例,同时收集上述患者临床信息。提取骨髓标本单个核细胞,检测骨髓NUPR1和自噬标记物mRNA相对表达量,分析NUPR1、自噬标记物及患者临床特征的相关性。2.体外细胞实验:构建靶向NUPR1基因shRNA慢病毒及阴性对照慢病毒,转染人MM细胞株（U266和RPMI 8226）。实验分为三组:未转染病毒空白组（Blank）、阴性对照慢病毒转染组（NC-LV）和NUPR1shRNA慢病毒转染组（NUPR1-LV）。应用流式细胞术检测转染效率,qRT–PCR及Western blot验证NUPR1沉默效果。透射电子显微镜（TEM）和单丹磺酰尸胺（MDC）染色检测NUPR1沉默对MM细胞自噬活性的影响;流式细胞术和Hoechst染色评估各组细胞凋亡情况;Western blot评估MM细胞自噬、凋亡相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达情况。以自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）及PI3K抑制剂LY294002处理MM细胞,Western blot检测相关蛋白表达水平。结果***患者骨髓单个核细胞NUPR1基因表达及自噬活性呈高水平:NUPR1基因及自噬标记物（Beclin1、ATG5和ATG12）mRNA水平在初诊MM患者骨髓标本中表达增加,且NUPR1与Beclin1、ATG5和ATG12基因水平呈正相关关系。骨髓NUPR1高表达与患者临床分期（RISS和D-S分期）?血钙水平和骨髓浆细胞数比例呈正相关,与血红蛋白水平负相关。***1 shRNA慢病毒成功转染人MM细胞:流式细胞术示NC-LV和NUPR1-LV组细胞转染率均达80%以上,qRT–PCR及Western blot证实NUPR1沉默效果显著。3.沉默NUPR1导致MM细胞自噬活性降低:TEM结果示NUPR1-LV组自噬小体较Blank和NC-LV组明显减少,MDC也显示NUPR1沉默组自噬颗粒减少,Western blot结果表明与Blank和NC-LV组相比,NUPR1-LV组LC3 II/LC3 I比值和Beclin1表达下调,P62蛋白表达上调。4.沉默NUPR1激活MM细胞凋亡:流式细胞术检测显示NUPR1-LV组凋亡率较NC-LV组明显增加,Hoechst染色也显示NUPR1-LV组凋亡细胞增加,且NUPR1沉默后MM细胞cleaved caspase3和BAX蛋白表达升高,BCL2表达降低。***1沉默通过抑制自噬活性促进MM细胞凋亡:RAPA处理后,Western blot发现NUPR1-LV组细胞自噬水平增加、凋亡减少;而3-MA干预后,NUPR1沉默组细胞自噬受抑、凋亡增加。***1通过PI3K/AKT/mTOR通路影响MM细胞自噬及凋亡:沉默NUPR1后MM细胞总PI3K、AKT、mTOR表达无明显变化,而磷酸化PI3K、AKT、mTOR表达增加;PI3K抑制剂LY294002处理引起细胞自噬活性增加?凋亡水平降低。结论MM患者骨髓单个核细胞NUPR1基因表达增高,自噬活性增强,且与患者临床特征存在一定相关性;沉默NUPR1可通过抑制MM细胞自噬活性诱导细胞凋亡,该作用由PI3K/AKT/mTOR通路介导;本研究结果提示NUPR1可能成为MM治疗的一个潜在靶点。