成年神经发生在苯并[a]芘暴露损害小鼠记忆功能中的作用机制研究

作     者：毛宏晖 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张文平

授予年度：2019年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：苯并[a]芘 学习记忆 恐惧记忆 成年神经发生 Wnt/β-catenin 小鼠 

摘      要：目的:研究苯并[a]芘暴露对小鼠学习记忆、恐惧记忆等行为的影响,以及其对大脑海马齿状回区成年神经发生的影响,并进一步探索Wnt/β-catenin信号通路是否参与相关的改变的调控。方法:选取健康8周龄C57BL/6雄性小鼠198只,随机分为3组:染毒组、溶剂对照组和生理盐水对照组。各组每天分别腹腔注射0.04%苯并[a]芘溶液(2mg/kg)、等体积橄榄油(5mL/kg)和等体积生理盐水(5mL/kg)连续10天,之后各组每天均腹腔注射1%BrdU溶液(100mg/kg)连续5天。在注射结束后的第1周和第3周各取8只分别进行新事物识别实验、Morris水迷宫实验、条件性恐惧记忆测试和开放旷场测试,以此检测苯并[a]芘暴露对小鼠新事物识别记忆、视觉空间记忆和条件性恐惧记忆功能的影响;每组另各取6只灌注后取材进行冰冻切片,通过免疫荧光染色的方法观察并计数海马齿状回区DCX/NeuN与BrdU的双阳性神经元的数量,并以此观察苯并[a]芘暴露对小鼠成年神经发生的影响。注射结束后1周,每组另各取6只取材做Western Blot,检测苯并[a]芘暴露对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin和Axin2表达的影响,观察Wnt/β-catenin信号通路是否参与调控成年神经发生并产生以上改变。采用GraphPad Prism 7和SPSS 21.0对数据进行绘图处理和统计学分析。实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示。多组之间经正态性和方差齐性检验后使用One-way ANOVA,事后检验采用Tukey’s多重比较;重复测量资料满足正态性、方差齐性和“球对称检验后使用Repeated measurement ANOVA;两配对样本资料满足正态性和方差齐性检验后使用Two-tailed paired t-test。当P0.05时,差异具有统计学意义。结果:1、行为学结果(1)新事物识别实验结果显示,与对照组动物相比,苯并[a]芘暴露组对新奇事物的识别次数(1wpi:F=26.330,P0.0001;3wpi:F=20.850,P0.0001)、穿越新奇事物所在区域的次数(1wpi:F=37.920,P0.0001;3wpi:F=16.350,P0.0001)和探索时间占比(1wpi:F=73.440,P0.0001;3wpi:F=51.160,P0.0001)均显著减少,且差异具有统计学意义(P0.05)。(2)Morris水迷宫实验结果显示,与对照组动物相比,苯并[a]芘暴露组在定位航行阶段寻找到平台的潜伏期显著增高(Fbetweengroup=13.100,P0.0001;Fwithin group=37.640,P0.0001);在空间探索阶段穿越平台的次数显著减少(1wpi:F=11.070,P=0.0011;3wpi:F=8.532,P=0.0034),且差异具有统计学意义(P0.05)。(3)条件性恐惧记忆和开放旷场实验结果显示,与对照组动物相比,苯并[a]芘暴露组小鼠的恐惧记忆水平受到了显著的抑制作用(Fbetweengroup=12.880,P0.0001;Fwithin group=363.70,P0.0001),并因此减少恐惧伴随情绪-焦虑的产生,且差异具有统计学意义(P0.05)。2、免疫组织化学结果小鼠大脑海马冠状冰冻切片后,进行免疫荧光双标染色,观察DCX与BrdU的双标情况以及NeuN与BrdU的双标情况,使用Image J进行计数分析,发现染毒组较对照组成年新生神经元数量明显下降(1wpi:F=13.270,P=0.0005;3wpi:F=17.420,P=0.0001),且差异具有统计学意义(P0.05)。3、蛋白印迹水平结果Western Blot实验结果显示,染毒组较对照组β-catenin(F=21.260,P0.0001)和Axin2(F=42.170,P0.0001)的表达均显著下降,说明苯并[a]芘暴露通过影响Wnt/β-catenin信号通路进而改变了小鼠海马齿状回区成年神经发生,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1、苯并[a]芘暴露会引起小鼠学习记忆功能受损和恐惧记忆水平下降;2、苯并[a]芘暴露会显著减少小鼠海马齿状回区的成年神经发生;3、苯并[a]芘暴露会显著影响小鼠Wnt/β-catenin信号通路的功能,并可能引起上述改变。