乳腺癌癌相关成纤维细胞中FOSL2/Wnt5a信号轴调控VEGF非依赖性血管生成及促肿瘤生长研究

作     者：万雪颖 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柳满然

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：癌相关成纤维细胞 FOSL2 Wnt5a VEGF非依赖性血管形成 

摘      要：目的:肿瘤新生血管形成是肿瘤的标志性特征之一。癌相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境的重要组成部分,不仅通过VEGF-VEGFR信号通路,而且通过VEGF非依赖的方式促进侵袭性血管生成。FOSL2属于转录因子AP-1家族中FOS亚家族成员之一,在乳腺癌中常上调表达。尽管如此,FOSL2在乳腺肿瘤CAFs中的作用仍未被揭示。本文以乳腺癌CAFs为对象,探究CAFs中转录因子FOSL2以血管内皮生长因子(VEGF)依赖和(或)非依赖方式促肿瘤血管形成及其分子机制。方法:1)通过qRT-PCR、WB验证乳腺癌原代及永生化CAFs中血管形成关键转录因子FOSL2上调表达的普遍性,免疫组织化学染色检测肿瘤血管形成标志蛋白CD31及对应间质成纤维细胞中FOSL2表达,以评价乳腺癌组织中血管密度(MVD)与FOSL2表达的相关性,同时对间质成纤维细胞中不同水平FOSL2对应的临床特征进行分析;2)构建FOSL2过表达和敲低细胞模型,利用细胞培养上清液(CM)与脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)共培养,探究FOSL2对HUVEC细胞侵袭、成管、出芽能力的影响;3)通过qRT-PCR、WB、ELISA检测构建细胞系中FOSL2表达与VEGFA表达的相关性,在CM中进一步添加抗VEGF单克隆抗体及VEGFR信号通路抑制剂Axtinib后,检测其对HUVEC细胞侵袭、成管、出芽能力的影响;4)分别用预测调控FOSL2主要信号通路的特异性激活剂作用NFs,特异性抑制剂作用CAFs,检测FOSL2 mRNA及蛋白表达以明确FOSL2上游信号通路的活化情况;5)利用生物信息分析、qRT-PCR、WB和启动子荧光素酶实验(LUC assay)、染色质免疫沉淀实验(CHIP assay)验证FOSL2对下游靶分泌因子表达的直接调控作用,并利用WB检测CM中靶分泌因子的分泌情况;6)构建靶分泌因子过表达和敲低细胞模型,利用CM与HUVEC共培养,验证靶分泌因子对HUVEC细胞侵袭、成管、出芽能力的影响;进一步在FOSL2过表达细胞的CM中加入靶分泌因子抑制剂,在敲低FOSL2细胞的CM中加入人重组靶分泌因子活性蛋白,检测其对HUVEC细胞侵袭、成管、出芽能力的影响,以验证FOSL2以下游靶分泌因子依赖的方式发挥生物学作用;7)利用WB检测FOSL2-靶分泌因子信号轴介导HUVEC下游信号通路,评价VEGF非依赖血管的形成关键分泌因子促内皮细胞血管形成的分子机制;8)裸鼠成瘤实验及临床标本体内验证FOSL2-靶分泌因子信号轴对肿瘤血管形成、肿瘤生长的影响。结果:1)乳腺肿瘤基质CAFs中FOSL2高表达,且与肿瘤血管生成和临床上乳腺癌进程预后密切相关;2)体外实验发现FOSL2高表达促进HUVEC侵袭、小管形成和出芽能力;3)抗VEGF单克隆抗体及VEGFR抑制剂Axitinib不能完全抑制NF FOSL2过表达的CM的促血管作用,FOSL2以VEGF非依赖的方式促进CAFs血管生成;4)CAFs中高表达芳香化酶,导致雌激素增多,激活cAMP/PKA信号通路,直接或间接调控促血管形成相关转录因子FOSL2的表达;5)FOSL2直接转录调控Wnt5a,导致CAFs中Wnt5a的分泌增加;6)FOSL2以Wnt5a依赖的方式介导CAFs中血管生成的促进作用;7)CAFs中的Wnt5a的分泌激活内皮细胞中FZD5/NF-κB/ERK信号通路;8)裸鼠成瘤实验进一步验证FOSL2-Wnt5a信号轴调控CAFs参与VEGF非依赖性的促血管形成,并发现临床乳腺癌病人血清中Wnt5a的含量与其肿瘤组织中血管密度密切相关。结论:FOSL2-WNT5A信号轴介导乳腺癌CAFs促进VEGF非依赖性血管形成,为临床靶向血管形成的肿瘤治疗提供新的启示。