和调健脾方修复抗生素相关性腹泻大鼠肠黏膜屏障的实验研究

作     者：李小雅 

作者单位：云南中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁嘉丽

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：和调健脾方 抗生素相关性腹泻 肠黏膜屏障损伤 肠道菌群 

摘      要：目的本研究选用云南省名中医李庆生教授临床治疗抗生素相关性腹泻有效方—和调健脾方,观察该方干预后大鼠肠道菌群及肠黏膜屏障相关指标变化情况,初步阐明和调健脾方干预抗生素相关性腹泻的作用机理,为中医药寻求多靶点治疗抗生素相关性腹泻提供理论依据,为临床防治该疾病提供新的思路。方法1.应用两联抗生素联合大黄水煎液复制脾虚型抗生素相关性腹泻大鼠模型。以大鼠行为学改变、结肠组织病理变化评价模型。2.和调健脾方各剂量组大鼠给予不同浓度和调健脾方水煎液灌胃,阳性对照组大鼠使用酪酸梭菌活菌散进行灌胃,空白对照组及模型组使用生理盐水灌胃。3.采用酶联免疫吸附测定法检测血浆中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）及大鼠结肠组织分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量;通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠结肠组织中Toll样受体4（Toll4）mRNA转录水平;通过气相色谱法检测大鼠肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）的含量;通过16S rRNA基因高通量测序检测大鼠肠内容物中菌群丰度。结果1.大鼠结肠组织病理切片结果:与模型组相比,和调健脾方低、中、高剂量组及阳性对照组中大鼠结肠组织肌层、黏膜水肿的情况改善,肠黏膜连续性有所恢复,表明经和调健脾方治疗后AAD大鼠结肠组织损伤情况明显改善。2.大鼠肠黏膜屏障指标结果:（1）DAO 与 D-LA:①DAO:与模型组相比,和调健脾方低剂量组中大鼠血浆DAO表达显著降低（P0.01）,中剂量组DAO表达呈下降趋势（P0.05）,高剂量组DAO表达明显降低（P0.05）,阳性对照组DAO表达呈下降趋势（P0.05）。②D-LA:与模型组相比,和调健脾方低、中、高剂量组中大鼠血浆D-LA表达明显降低（P0.05）,阳性对照组D-LA表达明显降低（P0.05）。结合AAD大鼠血浆中DAO、D-LA含量变化,表明经和调健脾方治疗后大鼠肠黏膜通透性降低,肠黏膜结构损伤得到修复。（2）SIgA 与 Toll4:①SIgA:与模型组相比,和调健脾方低、中剂量组中大鼠结肠组织SIgA表达明显升高（P0.05）,高剂量组中SIgA表达呈上升趋势（P0.05）。阳性对照组中SIgA表达显著升高（P0.01）。②Toll4:与模型组相比,和调健脾方低、高剂量组中大鼠结肠组织Toll4 mRNA转录水平显著降低（P0.01）,中剂量组中Toll4 mRNA转录水平呈下降趋势（P0.05）。阳性对照组中Toll4 mRNA转录水平呈下降趋势（P0.05）。结合AAD大鼠结肠组织中SIgA含量以及Toll4 mRNA的转录水平,表明经和调健脾方治疗后大鼠肠黏膜免疫功能增强。3.大鼠肠道菌群结果:（1）肠道菌群相对丰度:①门水平:模型组中大鼠的肠内容物菌群以Bacteroidetes（拟杆菌门）等的4个菌门相对丰度升高,而Firmicutes（厚壁菌门）等7个菌门相对丰度降低。和调健脾方组以Proteobacteria（变形菌门）等3个菌门水平相对丰度升高,Spirochaetes（螺旋体属）等2个菌门水平相对丰度降低。阳性对照组以Firmicutes和Proteobacteria为主的4个菌门相对丰度升高,以Bacteroidetes（拟杆菌门）为主的4个菌门相对丰度降低。②属水平:模型组中大鼠肠内容物菌群以Lactobacillus（乳杆菌属）、Prevotella（普雷沃均属）等的10个菌属相对丰度升高,Unspecified-Clostridiales、Unspecified-Lachnospiraceae等10个菌属相对丰度降低。和调健脾方组以Unspecified-Ruminococcaceae、CF231等的 4 个菌属相对丰度升高,Lactobacillus（乳杆菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）等5个菌属相对丰度降低。阳性对照组以Lactobacillus（乳杆菌属）和Unspecified-Clostridiales为主的14个菌属相对丰度升高,以Unspecified-S24-7和Prevotella（普雷沃均属）为主的6个菌属相对丰度降低。结合AAD大鼠肠道菌群门水平、属水平相对丰度变化,表明经和调健脾方治疗后大鼠肠道菌群结构发生变化,有益菌丰度增多,致病菌丰度降低。（2）SCFAs:与模型组相比,和调健脾方高剂量组乙酸、正丁酸含量呈上升趋势（P0.05）。和调健脾方低、高剂量组中丙酸含量呈上升趋势（P0.05）。阳性对照组中丙酸含量呈上升趋势（P0.05）。表明经和调健脾方治疗后可促进AAD大鼠SCFAs的表达。结论1.和调健脾方可通过修复抗生素相关性腹泻大鼠肠黏膜结构损伤,增强肠黏膜免疫功能,调节肠道菌群丰度,促进其代谢产物短链脂肪酸的表达,改善抗生素相关性腹泻。2.修复