乳香—没药配伍有效部位的制备工艺研究及其对缺血性中风的保护作用

作     者：缪晓冬 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宿树兰

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：乳香三萜酸 没药倍半萜 不同配比 缺血性中风 MCAO大鼠 神经炎症 血管生成生长 PC12 BV2 网络药理 

摘      要：本研究在国家自然科学基金(No.30973885)及江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(***-2015-12)的支持下完成,主要围绕乳香、没药有效部位的制备工艺优化,有效部位配伍对缺血性中风的改善作用与机制研究等,以期为该药对的进一步开发利用奠定基础。主要研究内容与结果简述如下:一、文献研究较为系统的归纳整理了乳香和没药的主要有效成分及药理活性,分析发现,乳香的主要有效成分为乳香酸类成分,包括五环三萜、大环二萜类成分等;没药的主要有效成分包括单萜类、倍半萜类、二萜类、三萜类,而以倍半萜类成分为主。现代药理活性研究表明,乳香、没药均具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等多种生物活性。为乳香、没药的进一步开放利用提供了科学依据。通过对缺血性中风的中医认识、病因病机及中风损伤的机制进行归纳总结,发现该疾病与去极化、钙超载、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等关系密切,为试验研究提供了理论指导。二、乳香没药有效部位的制备工艺研究1.乳香-没药配伍的中医临床应用特点分析通过数据挖掘方法分析乳香、没药药对在方剂中的配伍应用规律,将中医方剂数据库中含有乳香、没药的2236首方剂信息读取出来。统计出乳香-没药的配伍比例有50种,其中1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、5:3、3:4等7个比例出现频次较高,而以1:1形式配比的方剂高达1863首,故进一步围绕乳香-没药为1:1的方剂,对其所治疗疾病的科属、方剂功效和剂型及其网络关联性进行挖掘分析。结果发现,乳香、没药配伍多用于外科疾病,主要功效为活血化瘀、敛疮生肌、止痛、祛风、消痈散结、解毒、接骨续筋等,主要剂型为散剂、丸剂、膏剂等。2.乳香-没药不同配伍比例化学成分溶出分析应用UPLC-TQ/MS联用技术对乳香-没药不同配伍比例(1:1、1:2、2:1、2:3、3:2、3:4、5:3)的化学成分溶出变化进行分析。结果表明,乳香-没药不同配伍比例的化学成分溶出量不同,且配伍比例为1:1和2:1时溶出化学成分种类最为丰富,成分含量最高或较高。3.乳香中乳香三萜酸类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC-TQ/MS检测,以乳香中13个乳香三萜酸类成分(3-羰基甘遂-8,24-二烯-21-酸、3α-乙酰甘遂-7,24-二烯-21-酸、3-羟基甘遂烷-8,24-二烯-21-酸、乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸、3α-羟基甘燧烷-7,24-二烯-21-酸、11-酮基乳香酸、3-O-乙酰基-α-乳香酸、3α-乙酰氧基-羊毛甾-8,24-二烯-21-酸、3β-乙酰氧基-5α-8,24-羊毛甾二烯-21-酸、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、3-乙酰基甲氧基甘遂-8,24-二烯-21-羧酸、α-乳香酸、β-乳香酸)的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对乳香提取工艺的影响;采用碱溶酸沉法纯化乳香提取物并对纯化工艺参数进行单因素和正交试验考察,确定最佳纯化工艺为:95%乙醇20倍量回流提取4次,每次62 min为最佳提取工艺;以碱液pH为12～13溶解,在0～4℃用酸液pH2酸沉30 min为最佳纯化工艺,乳香三萜酸类成分纯度可达73.87%。4.没药中倍半萜类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC检测,以没药中2个倍半萜(2-甲氧基-8,12-环氧吉马烷-1(10),7,11-三烯-6-酮、2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1(10)-烯-6-酮)的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对没药提取工艺的影响;采用硅胶柱层析法纯化没药提取物并对纯化工艺参数进行单因素试验考察,确定最佳纯化工艺为:92%乙醇7倍量回流提取2.5 h/次,提取2次为最佳提取工艺;将乙酸乙酯部位用300-400目硅胶纯化,上样量为1:40,先用石油醚(PE)除杂,再用石油醚-乙酸乙酯(PE:EA)20:1的溶液作为洗脱剂洗脱3-6 BV为最佳纯化工艺,倍半萜类成分纯度可达 61.43%。三、乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用及机制研究1.乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用采用中脑动脉闭塞(MCAO)建立SD大鼠缺血性中风模型,通过神经功能评分确定模型建立成功,即模型大鼠出现提尾时损伤对侧前肢不能伸直;向损伤侧旋转;向对侧倾倒;不能自发行走,意识不清等。以乳香总三萜酸与没药倍半萜(BA-MS)的不同配伍比例(10:1、5:1、20:1,由药材配伍比例1:1、1:2、2:1折算)每天给药两次,给药3天后,收集血浆、尿液及脑/肺样本,分别进行生化指标测定、脑梗死面积测定,脑、肺组织病理学分析及Western blot法分析脑组织中AngI/AngII/Tie2信号通路与TLR4/N