基于沙丁胺醇抗体的β激动剂广谱免疫分析及3D-QSAR研究
作者单位：华南农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：雷红涛;加庆阳
授予年度：2017年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：β激动剂是一类临床上用于治疗支气管哮喘的药物。然而,由于一些β激动剂药物具有促进骨骼肌(瘦肉)生长、减少脂肪蓄积的作用,因而被当做“瘦肉精非法添加于动物性食品中。严重危害了消费者的身体健康。包括中国在内的许多国家都先后立法,明令禁止了在食品中将β激动剂类药物作为“瘦肉精进行非法添加。针对β激动剂的免疫检测方法,具有高灵敏度,检测用时短,处理步骤简单等优点,在食品安全领域有广泛的应用前景。但前人的研究,多建立特异性方法,无法在一次实验中同步检测多种β激动剂。因此,开发出一种针对β激动剂的广谱性免疫检测方法,是十分有必要的。本文选取选取β激动剂沙丁胺醇为研究对象,分别采用其消旋体和左旋体进行衍生并免疫得到多克隆抗体,建立了高灵敏度的酶联免疫分析方法和荧光偏振免疫分析方法,并根据抗体与小分子识别的交叉反应数据进行了定量构效关系分析,阐明了沙丁胺醇抗体与小分子的识别机制,并对广谱性半抗原设计提出了指导意见。(1)沙丁胺醇荧光偏振方法的建立采用琥珀酸酐法合成消旋及左旋沙丁胺醇免疫原。免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体。将沙丁胺醇衍生物分别用不同长度的荧光素EDF,HDF偶联获得四种荧光示踪物。经反应条件优化,建立荧光偏振免疫分析方法。Rac-sal-suc-EDF作为荧光示踪物所建立的标曲半抑制浓度(IC)为5.81 ng/mL,检测范围为1.43-23.56ng/mL;Rac-sal-suc-HDF作为荧光示踪物所建立的标曲IC为25.87 ng/mL,检测范围为7.77-86.24 ng/mL;R-sal-suc-EDF作为荧光示踪物所建立的标曲IC为85.80 ng/mL,检测范围为29.49-249.68 ng/mL,而R-sal-suc-HDF作为荧光示踪物所建立的标曲IC为197.98 ng/mL,检测范围为99.94-392.17 ng/mL。四种荧光示踪物所建立的荧光偏振方法分别能识别26,24,25和21种β激动剂。(2)沙丁胺醇间接竞争酶联免疫分析方法建立采用琥珀酸酐法合成消旋及左旋沙丁胺醇包被原,与多克隆抗体反应,建立间接竞争酶联免疫分析方法。左旋抗体的IC为0.5 ng/mL,检测范围为0.05-4.00ng/mL,LOD为0.04 ng/mL。消旋抗体的IC为2.10 ng/mL,检测范围(IC-IC)为0.11到40.86 ng/mL,检测限(LOD)为0.02 ng/mL。左旋抗体和消旋抗体分别可识别33和29种β激动剂。添加回收实验中,向猪尿样品中分别添加沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗及西布特罗药物,添加回收率为81.3-118.3%,且变异系数均小于15%,与高效液相-质谱联用方法进行比对,两种方法检测样品的结果存在良好相关性,证明两种抗体的间接竞争酶联免疫分析方法准确可靠。(3)沙丁胺醇抗体对小分子的广谱性识别机制研究基于沙丁胺醇抗体的交叉反应结果,应用CoMFA和CoMSIA两种算法,建立对沙丁胺醇的广谱性识别模型。结果表明:抗体与小分子作用时,存在多个结合位点。其中C-2和C-2?的叔丁基位置适当增大基团体积,有利于抗体识别。苯环C-2负电性增大,C-1和C-6所连接的基团负电性减小,会提高抗体对小分子的亲和力。而C-1?手性碳上的羟基和C-2?上所连接的叔丁基则由于疏水作用,而对抗体识别产生重要影响。此外,根据QSAR结果推断,右旋沙丁胺醇免疫所获得的抗体由于C-1?手性碳上所连接的羟基转向靠近疏水腔的一端,降低了抗体识别小分子的能力,因此左旋沙丁胺醇免疫得到的抗体表现出比消旋药物免疫得到的抗体更佳的广谱性。基于本研究对沙丁胺醇抗体识别小分子时重要位点的分析以及其它文献报道中对不同半抗原免疫所得抗体的交叉反应分析得出,小分子衍生手臂制备半抗原时,尽可能多的暴露重要识别位点,有利于提高免疫所得抗体的广谱性。通过本研究,建立了两种具有高灵敏度及广谱性的β激动剂免疫检测方法,并研究了沙丁胺醇抗体对小分子的广谱性识别机制,分析讨论了广谱性半抗原设计应遵循的规则,为β激动剂广谱性半抗原设计及免疫检测方法建立提供了重要参考。
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