大鼠皮肤癌痛模型的建立及Syndecan2信号通路在癌痛中作用的探讨

作     者：黄厚芹 

作者单位：蚌埠医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：何学明

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Walker256乳腺癌细胞 皮肤癌痛 Syndecan2 Syndecan3 Actin Heparanase 

摘      要：随着医疗水平的不断发展,癌症患者生存时间已大大延长。肿瘤相关性疼痛是肿瘤晚期患者最常见的症状之一,具体机制仍需要探索。疼痛渐渐成为肿瘤最无法容忍的症状,由于目前对导致癌痛机制的不明确,治疗药物的局限性(绝大多数治疗肿瘤相关性疼痛的药物都具有其耐受性及成瘾性等特点),仍有大约40%的肿瘤患者的疼痛得不到有效控制。目前虽然治疗癌痛的手段层出不穷,但就其治疗结果而言,仍旧不理想。因此,进一步研究癌痛机理及寻找缓解癌痛的有效方法成为当前慢性疼痛研究领域的热点之一。而研究癌痛机制的手段主要来源于癌痛动物模型的创建。骨癌痛模型是目前应用最广泛的动物模型,但是其制作较为复杂,所以皮肤癌痛模型以其便利性获得了较为普遍的应用。本实验将尝试应用大鼠足底注射Walker256乳腺癌细胞建立大鼠皮肤癌痛模型。目前,研究癌痛机制,寻找有效的缓解癌症患者的疼痛的作用靶点,成为当前研究肿瘤发生发展的主题。那么,在癌痛的发生发展过程中,是否存在一个特异性靶点,不仅能持续有效的缓解疼痛,又不会产生严重的副作用呢?近年来,随着研究的深入,发生在脊髓部位的突触重塑逐渐引起了我们的注意。而actin细胞骨架在其中的作用成为近期研究的热点。Syndecan2(SDC2)特异性地表达在树突上,且在树突棘的发生和成熟过程中发挥作用。硫酸乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)是syndecan家族体内的一个重要的调节酶,其功能是降解syndecan分子细胞膜外部分链接的糖蛋白链。而heparanase的降解功能或许为SDC2单体相互靠近提供了必要的条件。本实验通过在大鼠皮肤癌痛模型上检测heparanase、SDC2、SDC3及鞘内注射heparanase抑制剂OGT2115观察疼痛行为学变化,来探究SDC2信号通路在癌痛中的作用。本文研究分为两个部分。第一部分:大鼠皮肤癌痛模型的建立目的:探讨Walker256细胞足底注射建立大鼠皮肤癌痛模型的可行性。方法:将体重180-220g Sprague Dawley(SD)雄性大鼠30只随机分为三组:正常组、假接种组、接种肿瘤细胞组(TCI组),每组10只。TCI组为将含4×10/ml细胞悬液200ul注入大鼠后足跖面皮下;假接种组则注射等量的灭活细胞;正常组不进行接种。记录荷瘤足外观;测量大鼠足体积及疼痛行为学;荷瘤皮肤行Masson染色;免疫组化检测脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞活化;酶联免疫法检测荷瘤皮肤内神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的表达。结果:接种后2天观察到TCI组大鼠后足垫部出现红肿,随时间加重,观察结束时仍未消退,同时足体积持续增加;假接种组有短暂轻度红肿。TCI组大鼠后足跖面皮肤内见大量肿瘤细胞浸润,脊髓背角可见活化的小胶质细胞及星型胶质细胞。肿瘤细胞接种后8-17天TCI组出现机械痛敏和热痛敏,均与假接种组有显著的统计学差异(所有P0.05);荷瘤皮肤内NGF、IL-1β和TNFα均较假接种组表达增加(所有P0.05)。结论:Walker256细胞足底皮下注射可以成功建立大鼠皮肤癌痛模型。第二部分:Syndecan2信号通路在癌痛中作用的探讨目的:探讨SDC2信号通路在癌痛中的作用。方法:将40只SD雄性大鼠随机分为正常对照组(Naive)、假接种组(Sham)、接种肿瘤细胞组(TCI组)、实验组(TCI+OGT2115),每组10只。TCI组及实验组大鼠后足跖面皮下接种Walker256大鼠乳腺癌细胞悬液200μL(4×10/ml),制作皮肤癌痛模型。假接种组则注射等量的灭活细胞;正常组不进行接种。实验组大鼠在接种肿瘤细胞后第8天用微量注射器于脊髓鞘内注射硫酸乙酰肝素酶抑制剂OGT2115 20ul,浓度为6umol.L。正常对照组、假接种组及TCI组不进行注射。利用免疫组化和蛋白印迹两种手段检测并观察heparanase、SDC2及Syndecan3(SDC3)三种蛋白分子在脊髓背角的表达,观察疼痛行为学;结果:TCI组术后8-12天出现机械痛敏及热痛敏,与正常组有显著的统计学差异(P0.05),而实验组在术后8天注射OGT2115后,痛阈出现先上升后下降的趋势,于术后第11天降至TCI组水平,随后维持与TCI组相当。TCI组heparanase及SDC2在术后5天开始表达增加,与假接种组及正常对照组比较差异有统计学意义(P均0.05)。SDC3在3组的表达均无明显变化。结论:SDC2信号通路参与了癌痛的发生,脊髓鞘内注射OGT2115对硫酸乙酰肝素酶进行抑制缓解了癌痛引起的热痛觉过敏和机械痛觉过敏。