代代花治疗阿尔茨海默病药效物质基础研究

作     者：严欢 

作者单位：江西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：左月明;张忠立

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：代代花 化学成分 UPLC-Q-TOF-MS 阿尔茨海默病 

摘      要：目的:应用睡眠障碍阿尔茨海默病(Sleep Disorder Alzheimer’s Disease)模型大鼠(简称SDAD模型大鼠),通过对其行为学(Morris水迷宫)和相应生理生化指标的测定,研究新鲜代代花低温真空冷冻干燥花蕾及经AB-8大孔树脂洗脱的代代花乙醇洗脱部位在治疗SDAD上的药理作用。同时,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术对代代花化学成分进行分析鉴定,并通过各种柱色谱方法及波谱技术对70%乙醇有效部位进行分离纯化和结构鉴定,为研究代代花治疗阿尔茨海默病的药效物质基础提供依据。方法:1.采用低温真空冷冻干燥法及乙醇浸渍法得鲜代代花低温真空冷冻干燥花蕾及代代花乙醇浸渍物,后者浓缩浸膏经AB-8大孔树脂洗脱得30%乙醇洗脱部位,70%乙醇洗脱部位。利用睡眠剥夺致睡眠障碍及鼠脑室一次性注射Aβ淀粉样蛋白制作睡眠障碍阿尔茨海默病(SDAD)模型大鼠,通过行为学(Morris水迷宫)和生理生化相应指标的测定,对代代花各给药部位进行药理活性研究。2.采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术,结合Peakview软件中XIC Manager功能建立代代花已知化学成分的XIC数据库,依据测定相对分子质量及理论精确相对分子质量,确定各色谱峰对应化合物的分子式,结合相关化合物的一级质谱和二级质谱以及同位素分布和化合物裂解规律,并与对照品和文献进行比较,鉴定95%乙醇回流提取的新鲜代代花低温真空冷冻干燥花蕾样品的化学成分。3.运用硅胶柱色谱、聚酰胺树脂、ODS-C柱色谱和制备高效液相色谱法等现代分析分离技术,对代代花70%乙醇洗脱部位进行分离纯化与富集得单体化合物,并应用UV、IR、NMR和MS等技术与方法,解析鉴定上述单体化合物的结构。结果:1.与SDAD模型组(I/R)大鼠相比,代代花各给药部位能改善模型大鼠学习记忆能力,使动物的精神状态明显好转,体重增加速度趋于正常,血清中超氧化物歧化酶的水平升高,乙酰胆碱酯酶、丙二醛、谷氨酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶,NO、Ca含量均降低,表现出良好的抗氧化损伤及神经保护作用。2.利用Peakview软件中Formula finder功能,结合相关化合物的一级质谱和二级质谱,以及同位素分布与化合物裂解规律,并与对照品和文献进行比较,共鉴定和推测以黄酮类、三萜类、香豆素类和有机酸类为主的31个化合物的基本结构。3.代代花70%乙醇有效洗脱部位经不同柱色谱及NMR谱分析,共分离纯化并鉴定出23个单体化合物,其中二氢黄酮类化合物12个:theaflavanosideⅡ(1)、2(s)-theaflavanosideⅣ(2)、theaflavanosideⅢ(3)、橙皮苷(4)、新橙皮苷(5)、柚皮素-7-O-β-D-龙胆二糖苷(6)、2(s)-3′,4′-二甲氧基-5,7-二羟基黄酮-7-O-新橙皮苷(7)、枸橘苷(8)、6,8-二甲基-3′-甲氧基-5′-羟基-柚皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、2(s)-3′-甲氧基-5,7,4′-三羟基黄酮-7-O-新橙皮苷(10)、柚皮芸香苷(11)、柚皮苷(12);黄酮醇-3-O-糖苷类化合物3个:山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷(13)、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷(14)、4′-甲氧基-异槲皮苷(15);黄酮类:异橙黄酮(16)、6,7,8,3′4′-五甲氧基黄酮(17);1个苯丙素类:阿魏酸甲酯(18);1个三萜类化合物:柠檬苦素(19);1个倍半萜类化合物:Corchoionol C(20);其他类化合物3个:1-phenyl-1,2-ethanediol(21)、5,7-二羟基色原酮(22)、3-羟甲基呋喃鼠李糖苷(23)。结论:1.代代花各给药部位能使动物的精神状态明显好转,体重增加速度趋于正常,血清中SOD的水平升高,AchE、MDA、谷氨酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶,NO、Ca含量均降低,表现出代代花各给药部位可有效清除氧自由基,提高机体的抗氧化及神经保护能力,证实代代花各给药部位具有改善记忆功能减退和改善睡眠障碍的功能,对AD病症的发生发展起到良好的的防治作用。为代代花用于临床治疗阿尔茨海默病提供了理论依据。2.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术作为一种新型的分析技术,具有高分辨、高灵敏的定性能力和强大的结构表征能力,能快速准确的检测代代花中的化学成分,并更有效、真实地评价药材的质量。3.70%乙醇有效洗脱部位的化学成分主要是以糖苷形式及部分苷元形式存在的黄酮类化合物。共分离得到23个单体化合物,其中柑橘属中首次发现化合物8个:柚皮素-7-O-β-D-龙胆二糖苷(6)、6,8-二甲基-3′-甲氧基-5′-