DRG中蛋白二硫键异构酶PDI对小鼠疼痛行为的影响

作     者：蒲泽瑶 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜肖娜

授予年度：2019年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 1002[医学-临床医学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：蛋白二硫键异构酶 背根神经节 慢性疼痛 CCI CFA 

摘      要：蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)是巯基氧化还原酶,属于硫氧还原蛋白超家族。PDI的结构中主要包含两个酶催化活性域a、a’,其活性位点为CGHC;两个底物结合域b、b’以及C末端的内质网驻留信号KDEL。PDI主要存在于内质网(endoplasmic reticulum,ER)上是蛋白质折叠所需的氧化还原酶。PDI的表达变化或者酶活性的失调与一系列的疾病相关,如神经退行性疾病和心血管疾病。除了作为可溶性氧化还原酶存在于内质网中,PDI也存在于细胞外侧,PDI可以分泌或转运到细胞表面,细胞膜表面的PDI参与调节多种重要的生理过程,包括血小板活化、血栓形成、T细胞迁移及骨质瘤迁移等。疼痛是由躯体感觉神经元外周突触末梢感受各种伤害性刺激(温度刺激、机械刺激和化学刺激等),并将其转化为神经冲动向中枢传递,而引起的痛感觉。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告,引起机体一系列防御性保护反应。躯体感觉神经元的胞体在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),其神经末梢数量庞大支配各种周围组织包括皮肤、关节、呼吸道等。DRG神经元作为躯体感觉初级传入神经元,在痛觉信号传导过程中发挥着极其重要的作用。有研究发现DRG神经元不仅具有痛觉信号形成和传递作用,而且还兼具痛觉信号调节作用。另外有研究发现在疼痛模型中背根神经节DRG和脊髓中的PDI表达升高,使用PDI抑制剂可以使小鼠的痛阈值升高,缓解小鼠的疼痛症状。我们的前期研究也发现,特异性敲除DRG组织Nav1.8阳性神经元上的PDI可以缓解由缓激肽(BK)诱发的小鼠急性炎性疼痛症状。为了进一步证实PDI与疼痛的关联,本论文旨在探究PDI在背根神经节DRG组织中的特征性分布和分泌情况,以及PDI蛋白在慢性疼痛中的变化及其发挥的作用。第一部分PDI在小鼠背根神经节DRG的分布及其对小鼠急性疼痛行为的影响目的:分析背根神经节DRG中PDI的分布特性及分泌情况,同时探究外源性给予PDI对小鼠疼痛行为的影响。方法:(1)使用冰冻切片和免疫荧光技术观察PDI与DRG组织相关Marker基因如IB4,CGRP,NF200的共表达情况。(2)应用ELISA试剂盒检测DRG组织PDI的分泌情况。(3)应用流式细胞术检测DRG神经元表面PDI的存在。(4)制备重组蛋白二硫键异构酶hPDI和突变蛋白PDIoooo。应用SDS-PAGE方法检测重组蛋白的纯度。以Di-E-GSSG为底物检测重组蛋白的还原活性。(5)将hPDI和PDIoooo分别注射到野生型小鼠的右后脚掌,观察注射前和注射后第1、3、5、24h,小鼠对热刺激和机械刺激的反应阈值。结果:(1)通过免疫荧光方法,我们观察到PDI与IB4,CGRP,NF200阳性DRG神经元均有一定程度的共定位。其中神经丝蛋白(NF200)用来标记大直径DRG神经元;降钙素基因相关肽(CGRP)是特异性表达在肽类小细胞神经元上的分子标记物;植物凝集素(IB4)是非肽类小细胞神经元的分子标记物。我们的实验结果提示PDI在DRG大、中、小神经元中均有表达。(2)应用ELISA试剂盒检测DRG组织PDI的分泌情况。从实验结果中可以看出DRG组织可以分泌PDI,与对照组(普通DRG外液刺激)相比,High K和BK的刺激没有使PDI的分泌量增加或者降低。(3)应用流式细胞术检测DRG神经元表面的PDI。从实验结果中可以看出DRG神经元表面确有PDI的存在,High K刺激没有改变神经元表面PDI的含量,阳性细胞率和平均荧光强度与对照组(普通DRG外液刺激)相比均没有显著性差异。(4)重组蛋白二硫键异构酶hPDI和PDIoooo的制备、纯度及活性检测。体外扩增大肠杆菌制备重组蛋白hPDI和PDIoooo,浓度分别为7.50mg/ml和8.22 mg/ml;SDS-PAGE检测hPDI和PDIoooo纯度分别为90%和85%;hPDI有较强的还原活性而突变蛋白PDIoooo基本没有活性。(5)重组蛋白PDI对小鼠行为学的影响。行为学结果显示,与注射PDIoooo的对照组小鼠相比,注射hPDI后使小鼠的热刺痛阈值明显降低,并且呈现明显的组间差异,尤其在第3h和第5h对热刺激变得更敏感与对照组相比有统计学差异。而注射hPDI的小鼠在第5h和第24h对机械刺激变得更敏感与对照组相比有统计学差异,但组间比较与对照组无明显组间差异。结论:以上实验结果表明:***在DRG各类神经元中均有高表达;***可以分泌到DRG神经元外;3.外源给予PDI可诱发小鼠的疼痛过敏行为(尤其是热痛过敏)。第二部分慢性疼痛模型中DRG中PDI的表达变化及其对小鼠疼痛行为的影响目的:研究DRG中PDI蛋白在小鼠慢性炎性疼痛及慢性神经病理性疼痛中变化情况