靛玉红抗脂多糖诱导人结肠上皮细胞炎症的作用及其机制研究

作     者：臧思源 

作者单位：辽宁中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柳越冬

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：溃疡性结肠炎 靛玉红 PI3K/AKT NF-κB 

摘      要：目的:本研究应用脂多糖诱导人正常结肠上皮细胞构建溃疡性结肠炎细胞模型,模型建立成功后使用靛玉红干预细胞模型,通过酶联免疫吸附试验检测促炎细胞因子和抑炎细胞因子表达含量的变化,明确靛玉红的抗炎作用,并通过蛋白免疫印迹法、实时荧光定量PCR探索靛玉红改善炎症反应的作用机制与靶点。材料与方法:培养人正常结肠上皮细胞(HCoEpiC),使用脂多糖(LPS)刺激HCoEpiC使其产生炎症反应并根据炎症因子IL-6释放量确定LPS的最佳使用浓度从而明确模型建立的最优条件,建立模型后使用不同浓度靛玉红溶液对其进行干预,分析细胞存活率以确定靛玉红最佳用药浓度,同时使用不同浓度靛玉红溶液干预正常HCoEpiC,观察靛玉红对细胞存活率的影响,确定其安全浓度,根据上述实验获得条件将细胞随机分为6组:正常组、模型组、靛玉红组高、中、低剂量组和靛玉红联合组(靛玉红+PPM-18),除正常组外均使用LPS刺激HCoEpiC细胞构建UC模型细胞,治疗组加入相应浓度靛玉红进行干预,培养24小时后取材,使用酶联免疫吸附试验测试靛玉红对各组细胞上清液中促炎细胞因子(TNF-α、IL-12)和抑炎细胞因子(IL-4)释放量的影响,使用实时荧光定量PCR检测靛玉红对NF-κB的mRNA表达的影响,使用蛋白免疫印迹法检测靛玉红对各组细胞PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB蛋白表达量的影响。结果:1.不同培养时间下HCoEpiC的生长情况将12H,24H,48H三组数据OD均值进行比较24H48H12H,与12H组进行比较,24H组OD均值显著升高(P0.05)。2.不同浓度LPS对HCoEpiC的IL-6表达影响与正常组进行对比,其余各组IL-6浓度均显著增高(P0.05)。与LPS组进行对比,1μmol/L组细胞存活率上升(P0.05)。4.不同浓度靛玉红对LPS诱导HCoEpiC存活率的影响与正常组比较,其余各组细胞存活率均明显下降(P0.05),1μmol/L组、0.5μmol/L组、0.25μmol/L组、0.125μmol/L组细胞生存率显著上升(P0.05),0.5μmol/L组和0.25μmol/L组细胞存活率显著上升(P0.05)。5.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC促炎因子TNF-α表达的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组及联合组TNF-α表达量显著升高(P0.05)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红中剂量组、靛玉红联合组TNF-α表达量均显著降低(P0.01)。6.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC促炎因子IL-12表达的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组及联合组IL-