蛇床子催眠活性组分对原代海马神经元细胞神经递质及其受体与钟基因表达的影响

作     者：郝雨蒙 

作者单位：山西省中医药研究院 

学位级别：硕士

导师姓名：冯玛莉

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：蛇床子 异虎耳草素 原代海马神经元细胞 神经递质 生物钟基因 神经递质受体基因 

摘      要：目的:观察蛇床子催眠活性组分(HCC)、异虎耳草素(IS)对体外培养的原代海马神经元(PHN)细胞凋亡、释放神经递质含量的影响,以及对神经递质相关受体基因、生物钟基因表达的影响,探讨HCC、IS催眠作用机制。方法:***细胞培养与鉴定:体外培养SD乳鼠PHN细胞,倒置显微镜观察细胞生长状态,CCK-8法检测细胞活性,作出细胞生长曲线,在细胞生长状态最佳时,神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化法鉴定纯度。***、IS最佳给药浓度筛选:按1:10、1:2剂量距设置,采用CCK-8法二级检测24 h、48 h PHN细胞存活率。3.细胞分组与给药:在上述筛选浓度中取存活率显著高于空白对照组的浓度用于实验,将PHN细胞随机分为为空白对照、地西泮阳性对照(25μg·mL)、HCC低(25μg·mL)、中(50μg·mL)、高(100μg·mL)、IS低(5μg·mL)、中(10μg·mL)、高(20μg·mL)剂量共8组,给药后置37℃、5%CO培养箱中24 h、48 h。4.指标检测:分别于给药24 h、48 h后采用流式细胞术(FCM)分析PHN细胞早期凋亡率;酶联免疫吸附法(ELISA)检测PHN细胞上清液γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)等神经递质含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测给药24 h后PHN细胞GABA、5-HT相关受体基因及生物钟基因Clock、Bmal1、Cry1、Per1、Per2 mRNA表达量。结果:***细胞培养与鉴定:体外原代培养第7天海马神经元细胞生长状态良好、活性较高,鉴定纯度90%。***、IS对海马神经元细胞作用24 h、48 h细胞存活率最佳给药浓度:24h、48h后细胞存活率25μg·mL、50μg·mL、100μg·mL11 HCC显著高于空白对照组,200μg·mL11 HCC组显著低于空白对照组;24 h 10μg·mL、20μg·mL11 IS显著高于空白对照组,40μg·mL11 IS显著低于空白对照组,48h 5μg·mL、10μg·mL、20μg·mL11 IS显著高于空白对照组,40μg·mL11 IS显著低于空白对照组。因此HCC在25μg·mL00μg·mL、IS在5μg·mL0μg·mL细胞存活率最佳,确定HCC低、中、高浓度为25μg·mL、50μg·mL、100μg·mL、IS低、中、高浓度为5μg·mL、10μg·mL、20μg·mL作为本实验浓度梯度。***、IS对PHN细胞早期凋亡率的影响:HCC、IS作用PHN细胞24h后,地西泮阳性对照、HCC中、低、IS高、中剂量组显著低于空白对照组;HCC、IS作用PHN细胞48 h后,地西泮阳性对照、HCC中、IS高剂量组细胞的凋亡率显著低于空白对照组,HCC高剂量组细胞凋亡率显著高于空白对照组。***、IS对PHN细胞释放神经递质的影响:HCC、IS作用PHN细胞24 h后,GABA含量地西泮阳性对照、HCC高、中、IS高剂量组显著高于空白对照组,5-HT含量HCC高、中剂量组显著高于空白对照组,NA含量各组变化不明显;HCC、IS作用PHN细胞48 h后,GABA含量地西泮阳性对照、HCC高、中、IS高、中剂量组显著高于空白对照组;5-HT含量HCC各剂量组均显著高于空白对照组;NA含量地西泮阳性对照、HCC各剂量组、IS高剂量组均显著高于空白对照组。***、IS对PHN细胞GABA、5-HT相关受体基因表达的影响:HCC、IS作用PHN细胞24 h后,Gabra1、Gabbr1、5-HT1A(A))、5-HT1A(B))、5-HT、5-HTD mRNA表达量地西泮阳性对照、HCC高、中剂量组均显著高于空白对照组,5-HT1A(C))mRNA表达量地西泮阳性对照、HCC各剂量组均显著高于空白对照组,Gabra5 mRNA表达地西泮阳性对照、HCC高、IS高剂量组均显著高于空白对照组,Gabrb2 mRNA表达HCC高剂量组显著低于空白对照组、HCC低剂量组显著高于空白对照组;Gabra1、5-HT1A(A))、5-HT1A(B))、5-HT、5-HTD mRNA表达量IS高、中剂量组均高于空白对照组,Gabbr1、5-HT1A(C))mRNA表达量地西泮阳性对照组、IS各剂量组均显著高于空白对照组。***、IS对PHN细胞生物钟基因表达的影响:Bmal1 mRNA表达量地西泮阳性对照、HCC高剂量组显著低于空白对照组,Clock mRNA表达量IS高剂量组显著低于空白对照组,Cry1、Per1、Per2 mRNA表达量地西泮阳性对照、HCC中、高剂量组、IS中、高剂量组均显著高于空白对照组。结论:HCC、IS降低体外培养的PH