microRNA-191对脓毒症保护作用的机制研究

作     者：管菲 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王慧

授予年度：2019年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：脓毒症 microRNA-191 盲肠结扎穿刺术 巨噬细胞 细菌清除 

摘      要：研究背景:脓毒症(sepsis)指病原体感染宿主后引起免疫反应失常,造成危及生命的器官功能障碍。脓毒症在临床上常见于腹腔感染以及严重烧伤、创伤、外科手术后的并发症,其病理生理变化复杂,病情凶险、死亡率高。腹腔内细菌大量滋生是腹膜炎进展至脓毒症的首要原因。中性粒细胞及巨噬细胞是重要的专职吞噬细胞,在清除细菌、限制细菌扩散、控制脓毒症进程中发挥至关重要的作用。尤其是巨噬细胞寿命较长,可以持续发挥防御功能。microRNAs是一类目前发现在病毒基因组和真核生物里表达的单链小分子非编码蛋白的RNA,长度大约在18至22个碱基。大部分microRNAs是通过与下游靶mRNA的3端非编码区(3’-UTR)互补结合来使其降解或抑制其翻译过程,从而在转录后水平上调控动植物的生长发育,细胞增殖、分化、凋亡、代谢、免疫反应等生物学进程。近来研究报道miR-191在癌症、Ⅱ型糖尿病、肺动脉高压、阿尔兹海默症等疾病中异常表达。我们的前期实验结果证实miR-191亦参与肝IRI无菌性炎症反应,并发现miR-191通过促进凋亡,抑制细胞周期等方式促进肝脏IRI炎症损伤。那么,miR-191是否参与临床危急重症脓毒症的炎症损伤?通过对GEO数据库测序数据进行生物信息学分析,结果显示全身炎症反应综合征及脓毒症患者外周血miR-191表达显著下降,提示miR-191参与脓毒症,但其具体机制不明。研究目的:本文拟通过对脓毒症小鼠及相应细胞模型的研究,探讨miR-191在脓毒症中的作用及机制。研究方法:首先初步分析miR-191是否参与小鼠脓毒症。小鼠盲肠结扎穿刺术(Cecal Ligation and Puncture,CLP)模拟重度脓毒症模型,C57BL/6(WT)小鼠造模18小时后检测小鼠各组织器官及腹腔灌洗液中miR-191表达变化,初步验证miR-191是否参与脓毒症。进而探讨miR-191在脓毒症中的调节作用。以miR-191 KO和WT小鼠为模式动物,分别建立重度CLP模型,比较二者生存率、腹腔灌洗液及外周血细菌载量、不同类型白细胞比例,初探miR-191是否通过影响菌清除、炎症细胞浸润等调节脓毒症。基于前期实验数据,进一步分析miR-191是否通过影响中性粒细胞或巨噬细胞功能调控脓毒症菌清除。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分别刺激RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞系)、WT小鼠腹腔分离原代巨噬细胞或骨髓分离中性粒细胞4小时,检测miR-191表达变化,分析miR-191可能作用的靶细胞。在前期实验基础上,腹腔注射氯磷酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes)删除巨噬细胞后,比较miR-191 KO及WT小鼠CLP模型生存率,探讨巨噬细胞在miR-191调控脓毒症中的作用。接下来,体外实验探讨miR-191对巨噬细胞细菌清除功能的影响。调节RAW264.7和腹腔原代巨噬细胞miR-191表达水平,LPS刺激4小时后,用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)标记的大肠杆菌侵染巨噬细胞1小时,共聚焦显微镜(confocal)统计得出吞噬指数,并结合上清菌落培养计数,分析miR-191对巨噬细胞菌清除能力的影响。同时分离比较miR-191 KO及WT小鼠腹腔原代巨噬细胞细菌清除能力差异,确认miR-191对巨噬细胞菌清除的调节作用。最后,通过生物信息学预测筛选miR-191可能靶标,并在细胞模型中通过Real-time PCR及萤光素酶报告基因验证miR-191对靶标的负调控作用,初步探讨miR-191调控脓毒症的可能分子机制。研究结果:***造模18小时后,WT小鼠肝组织、肠组织、腹腔细胞内miR-191表达水平显著降低。提示miR-191参与脓毒症。***造模后,miR-191 KO比WT小鼠生存时间更短,腹腔及外周血细菌载量更高。提示miR-191减轻脓毒症。***造模后,miR-191 KO和WT小鼠腹腔中性粒细胞和巨噬细胞募集增加,但二者占白细胞比例及绝对计数没有差异。提示巨噬细胞及中性粒细胞均参与脓毒症。4.体外LPS刺激RAW264.7细胞和腹腔原代巨噬细胞,miR-191表达水平降低;但LPS刺激中性粒细胞,miR-191表达水平无差异。进一步删除巨噬细胞后重复CLP模型,miR-191 KO与WT小鼠生存时间较巨噬细胞删除前均缩短,且miR-191 KO更严重的损伤被消除,二者生存曲线无统计学差异。提示miR-191主要通过调控巨噬细胞功能减轻脓毒症,但对中性粒细胞功能无影响。5.调节RAW264.7细胞和腹腔巨噬细胞miR-191表达后进行吞噬与上清涂板试验,miR-191高表达RAW264.7细胞及腹腔原代巨噬细胞大肠