脾气虚大鼠模型优化及基于唾液淀粉酶影响因素观察四君子汤作用

作     者：梁雪丹 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李茹柳

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：脾气虚大鼠 外观体征评价 唾液淀粉酶 sAAN-糖基化 四君子汤 

摘      要：脾气虚动物模型的构建及优化是脾气虚证研究的重要内容,而模型的评价标准是脾气虚动物模型构建成功与否的关键环节。目前对脾气虚动物模型的外观体征评价大多以定性描述为主,缺少准确、客观定量的判断标准,易致评价模型动物外观体征时出现偏差,因而需要构建符合科学研究要求的脾气虚动物模型评价方法。唾液淀粉酶(salivary alpha-amylase,sAA)酸负荷前后活性比值、尿D-木糖排泄率是被行业认可的脾虚证疗效评价客观参考指标。研究表明,sAA属于N-糖基化蛋白,其活性与N-糖基化修饰密切相关;糖基转移酶(GnT-Ⅰ和GnT-Ⅱ)和α-甘露糖苷酶Ⅱ(MG-Ⅱ)是N-糖基化修饰的关键酶,直接影响N-糖基化程度。尿D-木糖排泄率、sAA活性比值及其影响因素(如N-糖基化修饰)等指标可作为评价脾气虚大鼠模型的重要客观指标。“以方测证是评价证候模型的常用方法,益气健脾代表方四君子汤常用于干预脾气虚模型,以此来评价脾气虚动物模型的可靠性。研究目的基于脾气虚证外观体征指标优化脾气虚大鼠模型评价标准;筛选利血平粉末致脾气虚大鼠的最佳剂量,建立优化后的脾气虚证动物模型;在此基础上,从脾气虚证客观诊断指标尿D-木糖排泄率、sAA活性改变及其影响因素来评价利血平致脾气虚大鼠模型;观察四君子汤对利血平致脾气虚大鼠模型sAA活性及其影响机制的影响;为探讨“脾气虚证微观指标及“脾主涎的内涵提供参考。研究方法1、优化脾气虚大鼠外观体征评价标准:选取活动度、眼裂宽度、毛色、大便构成脾气虚大鼠外观体征评分R,作为外观体征半定量评价标准;大鼠颈部皮下注射利血平不同剂量(0.8、0.4、0.2mg·kg-1)造模,初步确立外观体征评价标准的可行性;以0.8mg kg-1利血平复制模型,并增加0.6 mg kg-1利血平剂量组造模实验,以此重复验证外观体征评价标准的客观性和可靠性,以建立利血平致大鼠脾气虚模型实验方案,并为后续选取利血平合适剂量用于脾气虚大鼠造模。2、对溴苯胺法测定尿D-木糖排泄率。3、Bemfeld法测定sAA活性。4、凝集素亲和沉淀法检测sAAN-糖链构成比。5、Western blot 法检测 sAA、GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ 和 MG-Ⅱ 蛋白表达。6、腮腺的病理组织学观察:HE染色光镜下观察腮腺组织形态改变;透射电镜下观察腮腺组织超微结构(细胞器改变及酸刺激前后酶原分泌颗粒变化等)。7、四君子汤水提物的提取和分析:称取四君子汤药材(人参、茯苓、白术、甘草各等份),浸泡,水煎煮,浓缩冷冻干燥得四君子汤冻干粉,高效液相法检测四君子汤水提物图谱。8、四君子汤给药方法及观察:大鼠先随机分为正常对照动物和造模动物;造模动物以利血平0.6 mg·kg-1剂量颈部皮下注射造模11天,利血平注射结束后将造模大鼠随机分为四君子汤高、低剂量组(10g·kg-1、5g·kg-1),盐酸氟西汀(简称百优解,3.5 mg·kg-1)组,人参皂苷Rb1(40mg·kg-1)组,模型恢复组;四君子汤两组(10g·kg-1、5g·kg-1)、盐酸氟西汀(百优解)组大鼠灌胃给药,人参皂苷Rb1组大鼠腹腔注射给药,模型恢复组灌胃等量生理盐水,共(造模11d+给药22d)33天;实验结束后,收集大鼠唾液、尿液,选取大鼠腮腺组织用于后续实验。研究结果一、利血平致脾气虚大鼠模型的优化1、外观体征评分标准的优化:按大鼠外观体征评分标准,实验期间每天监测造模大鼠的大体状态变化过程,以体征评分R8或R1为标准,判断大鼠脾气虚模型复制成功或恢复至正常的节点;以外观体征评分结合体重、摄食量、饮水量、肛温和腮腺组织形态检查对模型进行评价并优化了模型评价标准;该结果以利血平0.8mg·kg-1造模9天中得到重复,也在利血平0.6 mg·kg-1造模11天中得到验证。2、脾气虚大鼠尿D-木糖排泄率:造模大鼠尿D-木糖排泄率较正常组大鼠下降(P0.05),说明脾气虚大鼠小肠吸收功能下降。3、脾气虚大鼠sAA活性:造模后大鼠酸刺激前后sAA活性较正常组大鼠下降(P0.01),表明脾气虚大鼠唾液分泌出现障碍。4、脾气虚大鼠sAA N-糖基化影响因素的观察(1)sAA与刀豆凝集素(ConA)和麦胚凝集素(WGA)结合率:造模大鼠与ConA结合率高于正常组大鼠(P0.01);表明脾气虚大鼠sAA N-糖链结构发生改变。(2)脾气虚大鼠sAA N-糖基化蛋白、糖基转移酶(GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ)、α-甘露糖苷酶Ⅱ(MG-Ⅱ)表达:初步实验证明造模大鼠sAA N-糖基化蛋白表达缺失,GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ表达有下降趋势,MG-Ⅱ无明显变化;提示sAA N-糖基化表达缺失及糖链结构改变可能与GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ表达改变有关。5、脾气虚大鼠腮腺病理组织学观察:腮腺组织HE染色光镜下观察,透射电镜超微结构