lncRNA-CP通过调控HIF-1α/VEGFA轴影响肾透明细胞癌侵袭迁移的研究

作     者：刘芳晓 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何苗

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：lncRNA-CP TCGA ccRCC 顺式调控 HIF-1α VEGFA 侵袭 迁移 

摘      要：目的:肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是成人中最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其中肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma,ccRCC)是肾癌中比例最高的亚型。由于肾透明细胞癌的复杂特性且其机制尚未完全研究清楚而受到广泛关注。长链非编码RNA(long non-coding RNA)作为多种癌症潜在的生物标志物已成为研究热点,但其在肾透明细胞癌中的研究仍然很大程度上未知。因此,本文旨在肾透明细胞癌中寻找全新的长链非编码RNA,进行其可作为肾透明细胞癌的新型生物学标志物和治疗靶标的机制探讨。本文首先从TCGA中鉴定出在肾透明细胞癌中高表达并且具有预后诊断价值的lncRNA(我们将之命名为lncRNA-CP),我们在UCSC数据库中确认其基因座信息,并找到基因CP与之基因组相邻近,接着探讨两者之间是否存在表达相关性并预测两者之间的顺式调控机制。我们还发现已有报道CP是HIF-1α、VEGFA体外已知的靶标,低氧环境下可以转录诱导CP启动子激活,引起CP表达升高。因此我们重点探讨lncRNA-CP是否通过调控HIF-1α/VEGFA轴进而影响肾透明细胞癌的侵袭转移。研究方法:我们首先从TCGA数据库筛选并鉴定新的lncRNA,lncRNA-CP。差异表达分析观察lncRNA-CP在ccRCC中的表达情况,Km-Plot法分析lncRNA-CP表达与ccRCC预后的关系。交叉表分析lncRNA-CP表达与ccRCC的临床病理参数的关系,Cox比例风险回归模型分析lncRNA-CP是否可作为ccRCC的独立预后风险因素。通过UCSC数据库确定lncRNA-CP与CP的基因座位置邻近关系。通过细胞核质分离实验确定在肾透明细胞癌ACHN和786-O细胞中lncRNA-CP的表达分布;应用qRT-PCR及Western Blot方法检测沉默lncRNA-CP后相关基因HIF-1α、VEGFA的mRNA及蛋白表达情况;同时细胞划痕和Transwell等实验来考察沉默lncRNA-CP对生物学特性的影响。结果:1.通过TCGA数据库,我们共鉴定出12个在ccRCC中高表达并具有预后价值的lncRNAs,并将lncRNAs进行Cox比例风险回归模型单因素及多因素分析,由此我们得到3个lncRNAs可以作为ccRCC独立风险因素,分别为RP11-206M11.7、RP5-884M6.1、LINC00460。最后我们也将这些基因进行了临床病理资料分析,发现以上3个lncRNA均与TNM分期或Fuhrman核分级(grade)有关。其中RP11-206M11.7在肾透明细胞癌中的影响暂无相关报道。因此我们选择RP11-206M11.7进行下一步分析(我们将其命名为lncRNA-CP)。2.通过核质分离实验验证lncRNA-CP主要定位于细胞核中。通过UCSC数据库确定lncRNA-CP与CP的基因座位置邻近关系,TCGA数据显示二者表达成正相关;CP在肾透明细胞癌中高表达且与不良预后有关。CP的临床病例参数分析显示其与gender,grade有关。3.沉默lncRNA-CP细胞模型构建成功。同时qRT-PCR检测CP的mRNA水平表达变化,发现沉默lncRNA-CP后CP表达同向降低;通过Transwell实验、细胞划痕实验发现沉默lncRNA-CP后细胞侵袭迁移能力减弱。在786-O、ACHN中沉默lncRNA-CP后qRT-PCR检测VEGFA、HIF-1α的mRNA表达水平降低。同时western blot检测发现干扰lncRNA-CP后VEGFA、HIF-1α蛋白表达水平呈同向趋势下降,VEGF-R无明显变化。结论:***-CP在肾透明细胞癌中高表达并作为独立预后风险因素。***中lncRNA-CP与邻近基因CP表达呈正相关。3.沉默lncRNA-CP抑制ccRCC侵袭迁移能力。4.沉默lncRNA-CP抑制ccRCC中HIF-1α和VEGFA表达。