家蚕抗菌蛋白Attacin 1对球孢白僵菌的抗菌活性及抗菌肽Cecropin A的表达特征

作     者：胡丛武 

作者单位：江苏科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭锡杰

授予年度：2019年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：家蚕 球孢白僵菌 抗菌肽 Attacin1 Cecropin A 单克隆抗体 

摘      要：抗菌肽是宿主在免疫过程中产生的一类重要抗菌复合物。家蚕Attacin 1(BmAttacin1)蛋白是抗菌肽中的一种,其开放阅读框(ORF)编码214个氨基酸。我们的前期研究中发现BmAttacin 1基因在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)感染的家蚕幼虫体内显著上调表达。本文运用生物信息学软件预测其N端17号氨基酸为信号肽,成熟蛋白三级结构主要形成反平行β-片层结构;实时荧光定量PCR检测结果进一步证明家蚕幼虫在被球孢白僵菌感染后BmAttacin 1基因显著上调表达。以家蚕大造(p50)品种幼虫三龄起蚕cDNA为模板,克隆出BmAttacin 1成熟蛋白编码序列,利用原核表达系统成功表达获得BmAttacin 1蛋白,抑菌圈实验结果表明BmAttacin 1对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和球孢白僵菌有明显的抑菌效果,而对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)没有抑菌效果;进一步将BmAttacin 1与球孢白僵菌分生孢子孵育,间接免疫荧光检测发现BmAttacin 1能与球孢白僵菌分生孢子结合。在家蚕培养细胞(BmN)过表达BmAttacin 1基因后,家蚕其它七种抗菌肽基因也都上调表达,其中天蚕素类抗菌肽BmCecropin A基因的表达上调了10倍,BmCecropin B上调了9倍,表明BmAttacin 1基因的表达可能对其它抗菌肽基因的表达具有协同增强作用。本结果为深入研究BmAttacin 1与球孢白僵菌的相互作用以及BmAttacin 1在家蚕抵御球孢白僵菌感染过程中发挥的作用奠定了一定的基础。家蚕Cecropin A(BmCecropin A)也是抗菌肽的一种,其ORF编码63个氨基酸。课题组前期研究发现BmCecropin A在家蚕体内体外都对球孢白僵菌有明显的抑菌作用,但其发挥作用的具体机制还不清楚。本文根据NCBI登录的BmCecropin A的ORF序列,运用生物信息学软件预测其12号氨基酸为信号肽,抗原表位氨基酸序列为AIAVIGQA,结合对BmCecropin A成熟肽结构的分析及同源序列的比对,化学合成法合成BmCecropin A 233以及513两条氨基酸序列,分别偶联KLH和BSA后以此为抗原混合免疫Balb/c小鼠,蛋白质印迹检测结果表明免疫后的小鼠血清对BmCecropin A具有特异性抗原抗体反应;通过细胞融合和杂交瘤细胞株筛选,获得两株阳性杂交瘤细胞。利用杂交瘤细胞株培养基上清对大造品系家蚕血淋巴进行蛋白质印迹检测,结果显示其中一株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能在PVDF膜上与抗原结合产生单一条带,大小约为5 kD,即为目的蛋白BmCecropin A,表明该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可识别BmCecropin A的线性表位,不依赖于抗原的特定构象。用该株杂交瘤细胞制备单克隆抗体并通过蛋白质印迹检测BmCecropin A在家蚕各组织中的特异性表达情况,结果仅在脂肪体组织中检测到特异性抗体抗原反应。异丙醇沉淀法提取家蚕血淋巴蛋白,蛋白质印迹检测发现感染球孢白僵菌32 h的家蚕幼虫血淋巴中抗菌肽Cecropin A上调表达。本结果为BmCecropin A的深入研究及论证其在家蚕抵御球孢白僵菌侵染过程中发挥的重要作用奠定了基础。