一种催化合成α-熊果苷的基因克隆表达优化及其酶学性质和工业化应用研究

作     者：王益栋 

作者单位：浙江工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张朝晖;陈小龙

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 081702[工学-化学工艺] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：转葡萄糖苷酶 α-熊果苷 克隆表达 纯化 酶学性质 自诱导 

摘      要：α-熊果苷属于氢醌葡糖苷类化合物,其通过糖苷键将一个α-D-吡喃葡萄糖与对苯二酚一侧的酚羟基偶联,是一种高效、安全、绿色、普遍使用的酪氨酸酶抑制剂,它同时还具有抗菌、抗肿瘤、消炎、美白、治疗尿路感染等作用。实验从野油菜黄单胞菌基因组中克隆相关基因,用于构建重组大肠杆菌催化合成α-熊果苷。将构建的重组大肠杆菌通过乳糖诱导进行表达优化。同时研究重组大肠杆菌的酶学性质,为后续全细胞催化剂做铺垫。最后利用大孔吸附树脂对α-熊果苷产物进行分离纯化。将来自野油菜黄单胞菌的转葡萄糖苷酶基因与表达载体pET28a(+)连接,成功构建质粒pET28a-agl,筛选出高效表达转葡萄糖苷酶的基因工程菌*** BL21 Gold(DE3)plysS pET28a-agl,用于催化合成α-熊果苷。以乳糖为诱导剂进行转葡萄糖苷酶表达优化,得出最佳诱导时间为转接后150 min,此时的菌体的OD是0.9;最佳的乳糖诱导浓度为0.5 g/L;最佳诱导温度28℃;最佳诱导时间为8h。论文采用自诱导培养基进行产酶具有显著的优势,其菌体量和蛋白表达量是使用IPTG和乳糖诱导的2倍,且其转葡萄糖苷酶活性分别是IPTG诱导的33倍和乳糖诱导的15倍,可以使菌体在后期的应用中获得更广阔的应用前景。论文对转葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究。研究表明,重组转葡萄糖苷酶在酶浓度为0.2725 mg/mL下,其最佳反应条件为:该酶在4-30℃温度范围内保持稳定,在30℃时该酶的相对酶活力最高,其最适pH为6.5,最适底物浓度为11 g/L,反应产物对酶反应有轻微的抑制,金属离子Cu能抑制99.9%的转葡萄糖苷活性,K可以提高20%的酶反应速率。在此条件下,α-熊果苷的产量能达到23 g/L,对苯二酚转化率达88%。对全细胞催化的研究中,0.5‰的CTAB能提高3倍酶催化效率;分批添加底物研究中,在30h的催化进程内,总共添加2.23%的对苯二酚,最终转化率达90.9%,α-熊果苷最终产量达50.31 g/L。采用purolite大孔吸附树脂MN202对α-熊果苷分离纯化进行研究,分别通过静态吸附和动态吸附摸索分离α-熊果苷的条件。MN202吸附能力在30min最佳;当初始α-熊果苷的浓度达到20 g/L时,树脂达到了吸附饱和,单位质量的MN202树脂可吸附80 mgα-熊果苷;在25℃条件下,Freundlich方程为:ln Qe=0.2616×ln Ce-9.168,R=0.9990;初始上样的α-熊果苷溶液浓度为18 g/L,最佳的上样量为5个柱体积;上样后,依次采用10%和20%乙醇洗脱最佳。