纳米声敏剂调控线粒体自噬增强脑胶质瘤声动力治疗效果的研究

作     者：瞿飞 

作者单位：陕西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘全宏

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：声动力疗法 血脑屏障 线粒体自噬 纳米声敏剂 原位脑胶质瘤 

摘      要：脑胶质瘤是一种常见且极具侵袭性的中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）肿瘤,具有非常高的死亡率和复发率。血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）被证明是限制胶质瘤治疗效果的关键因素之一,BBB能够阻止治疗性药物进入胶质瘤病灶部位,从而局限了胶质瘤的化疗效果。因此如何促进药物穿越BBB,实现靶向和富集是脑胶质瘤治疗中亟待解决的问题。近年来,大量研究表明超声靶向微泡爆破技术（Ultrasound-targeted Microbubble Destruction,UTMD）能够可逆且瞬时开放BBB,同时该技术具有高度的空间和时间特异性,是目前唯一能够靶向、安全、有效递送药物通过BBB到达病灶的新方法。声动力疗法（Sonodynamic Therapy,SDT）不仅能够利用超声波的穿透力作用于体内肿瘤组织,激活富集在病灶部位的声敏剂从而对肿瘤产生杀伤效果,同时超声波可以穿过颅骨进行深层次的成像和疾病诊断,因此将声动力疗法应用于脑胶质瘤的无创诊疗,具有经典疗法无可比拟的独特优势。而将声敏剂高效地运送至肿瘤区域,是声动力治疗脑胶质瘤的关键。纳米药物递送系统（Nano-Drug delivery system,Nano-DDS）具有良好的靶向性和安全性,能够在提高药物的生物利用度的同时降低毒副作用,是目前新型药物递送的研究热点。纳米载体种类繁多,如脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物、其它无机纳米颗粒等,均可作为载体携带抗癌药物或小分子物质进入目标靶位,显著提高疾病的靶向安全治疗效果。自噬是一种细胞内的维稳调控机制,通过自噬过程,部分受损的细胞器和功能失调的蛋白质或其他组分可以在溶酶体中降解,参与细胞内结构和功能大分子的循环重构。前期研究表明,SDT在诱导肿瘤细胞凋亡过程中会促发细胞自噬应答,肿瘤细胞内自噬活性的提高可以拮抗SDT的抗肿瘤疗效。因此,将自噬抑制剂作为潜在的抗肿瘤药物,阻断肿瘤的自我保护途径,是抗肿瘤治疗的一个新思路。本研究通过UTMD技术可逆打开BBB,利用靶向肽Angiopep-2修饰的脂质体将装载的声敏剂二氢卟吩e6（Ce6）和自噬抑制剂羟基氯喹（Hydroxychloroquine;HCQ）富集于原位脑胶质瘤病灶,应用超声激活进入脑胶质瘤的Ce6杀伤肿瘤细胞并释放HCQ阻断细胞自噬的产生,增敏SDT的抗肿瘤疗效。论文主要从共载脂质体的合成及靶向修饰、离体细胞实验和在体动物实验三方面探究SDT对胶质瘤的细胞杀伤效应,旨在为SDT应用于脑胶质瘤的治疗,提升SDT的抗肿瘤疗效提供有价值的理论依据和实验基础。研究结果主要从三个方面概述:第一部分羟基氯喹和二氢卟吩e6共载脂质体的制备与表征选择PEG化的脂质体作为声敏剂Ce6和自噬抑制剂HCQ的药物装载平台,亲脂性的Ce6位于脂质体双层膜的磷脂双分子层中,水溶性的HCQ位于脂质体的亲水内核。通过薄膜水化法分别制备二氢卟吩e6脂质体（CL）、靶向肽Angiopep-2修饰的二氢卟吩e6脂质体（ACL）、二氢卟吩e6和羟基氯喹共载脂质体（CHL）、靶向肽Angiopep-2修饰的二氢卟吩e6和羟基氯喹共载脂质体（ACHL）。采用透射电子显微镜观察所制备的几种脂质体的形貌特征;使用激光粒度仪测定不同脂质体的粒径分布和分散系数以及血清稳定性;建立紫外分光光度法测定HCQ和Ce6的包载效率;评估在超声条件下的药物体外释放规律。主要得出以下结论:①制备的脂质体粒径均一、形态规则、性质稳定。②CL中Ce6的包封率为82.46±4.26%,ACL中Ce6的包封率为77.68±3.15%,在CHL共载脂质体中Ce6与HCQ的包封率为66.74 ± 3.58%和70.42 ± 2.88%,在ACHL共载脂质体中Ce6与HCQ的包封率为 54.16 ± 2.19%和 63.21±3.01%。③在 0-60 min 内,超声处理下 ACHL 中,Ce6或HCQ释放速率极大增高并呈突释状态,在60 min时药物积累释放量达到70%左右;与此相反,对照组中药物缓慢释放,在6h内药物释放无明显变化。第二部分超声联合ACHL脂质体体外抗脑胶质瘤效应研究选用高表达LRP的小鼠脑胶质瘤细胞系GL261、小鼠大脑内皮微血管细胞系bEND.3,以及低表达LRP的小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3三种细胞对ACL的体外靶向性进行考察,同时对游离Ce6、CL、ACL在GL261细胞中富集规律进行评估;利用激光共聚焦显微镜观察声敏剂Ce6在细胞内的分布。采用MTT法和钙黄绿素探针检测法考察CL、ACL、CHL、ACHL分别结合超声辐照所产生的细胞毒效应;荧光显微镜、流式细胞仪结合DCFH-DA研究在不同处理模式下,GL261细胞内活性氧的生成;利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对超声作