部分中药对斑马鱼的发育毒性及其靶器官的初步研究
作者单位：北京中医药大学
学位级别：硕士
导师姓名：林瑞超
授予年度：2016年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：传统中医药是我国的医药宝库,中药以其独特的疗效越来越受到世界的关注。毒性中药是中医临床治疗的重要组成部分,它对于疾病的防治具有十分积极的作用,利用有毒中药的毒性作用进行中药的研发也越来越受到研究者的重视,乌头的麻痹功效能够用来治疗疼痛性疾病,瓜蒂、常山的催吐作用能够治疗因痰液滞留引起的胸膈疾病,此外,利用眼镜蛇毒的镇痛作用治疗小儿麻痹后遗症等。但是近年来,中药在临床上不良反应事件的报道在一定程度上严重损害了中医药的良好信誉,动摇了其在国际医药市场的地位。因此,现代毒理学认为通过使用现代药理学的方法,对临床上普遍使用的中药做安全性评估,确立合理的安全评价指标,能够促进中药“以毒攻毒理论研究的完善和发展,为临床实践提供有效支撑,还能够促进中药与国际接轨。近年来,斑马鱼已经成为一个可替代的动物模型来进行药理和毒性研究。斑马鱼胚胎和幼鱼的体积较小、适合在96孔板中进行培养。斑马鱼具有较高的保守性,斑马鱼内部组织的表型、分子基础以及器官的发育都与别的脊椎动物模型相同或者相似,例如斑马鱼神经、心血管、视觉系统在解剖、生理和分子水平上都与人类相似,斑马鱼体内存在着许多参与脊椎动物发育和生理途经的基因的特征。斑马鱼的主要器官在96hpf完全形成,并且在7dpf之前斑马鱼幼鱼能够通过吸收卵黄中的营养物质维持生命而不需要喂食,在这个发育阶段中,斑马鱼依旧具有透明性,在显微镜下能够对内部器官实现非侵入性的直接观察,在毒理学实验中这种直接观察靶器官的方式可获得多角度实验资料,更便于评价毒理学实验的终点。重要的是,药物在斑马鱼体内能够引起相似的机体响应,药物对斑马鱼的毒性特征与哺乳动物相似或者一致。此外,近年来,斑马鱼解剖技术、组织切片技术以及组学技术在斑马鱼研究中的广泛应用更加促进斑马鱼模型成为分析药物毒性较好的替代模型。本研究中,我们尝试通过斑马鱼模型采用客观的可量化的指标体系对药典中具有不同毒性大小的19种有毒中药进行毒性评价。我们分别选择6hpf的胚胎、2dpf和4dpf的斑马鱼幼鱼对药典中不同毒性大小的中药进行发育毒性、急性毒性研究以及使用吖啶橙染色方法对斑马鱼的毒性靶器官进行研究,确定药典中毒性中药对斑马鱼的不同脏器发育以及脏器功能的影响,以中毒症状、脏器损害程度、量-毒曲线为指标来评价中药的毒性大小。在此基础上,将所获得的实验数据与文献中报道的关于毒性中药对传统动物模型的结果进行比较,尝试通过生物统计学知识建立斑马鱼模型与哺乳动物模型之间在毒性中药分级方面数据的相关性,为未来毒性中药的毒性分级和临床使用提供依据。研究方法:1建立了稳定的斑马鱼养殖系统2以斑马鱼胚胎为动物模型进行有毒中药的发育毒性研究,观察药物对不同脏器的发育毒性。3以斑马鱼为动物模型,初步确定毒性中药对斑马鱼的毒性靶器官。4比较斑马鱼模型和传统哺乳动物模型在毒性靶器官方面的差异,评价毒性中药在斑马鱼和哺乳动物模型中靶器官的相关性。实验结果:1熟练的掌握斑马鱼养殖过程和注意事项,斑马鱼养殖系统具有足够的稳定性,达到了相关的养殖标准:正常条件下,亲鱼的受精率达到70%以上,胚胎的孵化率达到90%以上,且死亡率小于10%。2不同毒性的中药对斑马鱼发育过程具有不同的毒性效果。药物对斑马鱼具有不同的致畸效果,如自主抽动缺失或者减少,心率缺失或者降低,孵化率降低,脏器表型发生改变等。3不同毒性的中药对斑马鱼的主要脏器的毒性效果不同,由于吖啶橙能够透过死亡细胞的细胞膜,标记其核苷酸,在荧光显微镜下可观察到较强的绿色荧光,因此我们通过吖啶橙染色法初步确定了毒性中药的毒性靶器官。总结:我们通过本实验室养殖的斑马鱼系统对药典中不同毒性中药进行发育毒性,急性毒性以及毒性靶器官的研究,实验结果具有明显的可重复性,为斑马鱼进行高通量毒性研究、完善中药毒性理论提供数据,为未来毒性中药在临床上的安全使用提供依据。
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