MiRNA联合标记物对肾透明细胞癌发展及不良预后的评价分析

作     者：王金龙 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何苗

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：微小RNA 肾透明细胞癌 预后 肿瘤基因组图谱 生物信息学分析 基因功能富集 

摘      要：目的:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,约占成人恶性肿瘤发病率的3%。肾透明细胞癌是肾细胞癌的主要表型,大约占到80%。MiRNA是由大约22个核苷酸构成的单链、内源性非编码小分子RNA,相对稳定,miRNA参与了众多的生物学过程。目前虽已发现一些miRNA与肾透明细胞癌密切相关,但多为单个的miRNA的标记物的研究,因单个miRNA标记物往往特异性不高,所以本研究旨在寻找多个miRNA联合标记物去准确预测肾透明细胞癌患者的预后。方法:本研究从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载与肾透明细胞癌相关数据集,分析癌与癌旁组间miRNA的表达差异。并从其中获取了539例肾透明细胞癌患者的miRNA表达谱和临床资料表,通过Kaplan-Meier曲线法对肾透明细胞癌患者进行生存分析,以此来筛选出具有潜在生物标记物特性的miRNA。通过在线的miRNA数据库:miRWalk、miRDB、DIANA TOOL和miRDIP来预测差异miRNA的靶基因。然后,利用共同的靶基因进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)基因富集分析来探究靶基因参与或者相关的生物过程和信号通路。差异表达的miRNAs同时也经过了RT-qPCR在肾透明细胞癌细胞系的验证。同时,差异表达miRNA与临床病理特征等也通过卡方分析、COX单因素和多因素分析等进行分析。结果:1、TCGA肾透明细胞癌数据中筛选得到72例癌旁组织和537例肾透明细胞癌组织样本纳入到研究,进行差异表达miRNA分析。筛选出在肾透明细胞癌癌与癌旁组织中263个差异表达miRNA,其中包括164个上调的miRNA和99个下调的miRNA(P1)。2、根据TCGA数据库提供的肾透明细胞癌表达谱芯片和临床资料,将上一步得到的差异表达miRNA通过Klan-Meier法进行生存分析,发现了miR-612、miR-616-5p、miR-760高表达的肾透明细胞癌患者具有较短的总生存时间,即预后不良。在卡方分析分析中,miR-612的表达与组织学分级相关;miR-616-5p的表达与T分期、组织学分级和病理分期相关;miR-760的表达与T分期、N分期、组织学分级和病理分期相关。3、Cox单因素和多因素分析显示这三个联合的miRNA标记物有潜力成为肾透明细胞癌重要的预后标记物。Cox单因素分析中,根据联合miRNA的风险评分,分为高低风险表达组,生存曲线显示其与患者预后生存时间相关。Cox单因素分析的结果显示:病理分期(HR=3.784,P0.001),T分期(HR=2.972,P0.001),M分期(HR=4.186,P0.001),组织学分级(HR=2.653,P0.001),三个miRNA联合标记物(HR=1.546,P=0.005)与肾透明细胞癌患者预后总生存明显相关;多因素分析的结果显示:T分期(HR=1.794,P=0.002),M分期(HR=2.080,P=0.036),组织学分级(HR=2.400,P0.001)和三个miRNA联合标记物(HR=1.499,P=0.012)是预测肾透明细胞癌患者预后的独立因素4、三个miRNA有241个共同的靶基因,进行基因功能富集分析。生物过程和分子功能分析显示靶基因与基因沉默、细胞蛋白代谢、低氧、核酸结合,转录因子丝氨酸/苏氨酸激酶受体信号活性等有关。细胞成分分析显示靶基因参与核小体、核质、细胞质基质、核染色质、蛋白复合体、转录因子复合体、胞外外泌体、细胞-细胞粘附链接等。KEGG通路分析显示靶基因参与了p53、低氧诱导因子1、AMPK、肾细胞癌、肿瘤中转录失调等信号通路。5、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)结果显示三个miRNA(miR-612、miR-616-5p、miR-760)在肾透明细胞癌细胞系中高表达。结论:1、MiR-612、miR-616-5p、miR-760与肾透明细胞癌患者预后总生存以及TNM分期、病理分期等临床特征相关。联合三个miRNA的高风险组患者预后不良。2、三个联合的miRNA(miR-612、miR-616-5p、miR-760)共同靶基因参与了与肾透明细胞癌的发展相关的生物学进程与信号通路。3、三个联合的miRNA(miR-612、miR-616-5p、miR-760)标记物可作为肾透明细胞癌发生发展及预后评价的潜在标志物。