冬小麦叶片和茎尖分生组织中miRNA的时空表达研究

作     者：魏康宁 

作者单位：河南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李用芳;王丽

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：冬小麦 叶片 茎尖分生组织 miRNA 表达谱 靶基因 

摘      要：小麦可分为冬小麦和春小麦,冬小麦在生长发育过程中必须经过一段时间的低温诱导才能够正常开花结实,即春化作用,而春小麦则不需要。冬小麦在我国的小麦总产量中占据90%以上,可见其在我国国计民生中的重要地位。有关小麦春化作用的生理过程、关键的调控基因研究得较为清楚。miRNA是一类重要的转录后调控因子,保守miRNA的靶基因大多为转录因子,转录因子可以调控多个下游基因的表达,因此miRNA在植物正常的生长发育及逆境胁迫中参与了重要的调控作用。miRNA在拟南芥和水稻生长发育过程中的调控作用研究得较为清楚,而小麦miRNA的研究主要集中在逆境胁迫和籽粒发育方面,miRNA在冬小麦生长发育过程中的调控作用不太明了。miRNA官方数据库miRBase(Release 22.1)中,水稻有738个成熟miRNA,拟南芥有428个、短柄草有525个,而六倍体的小麦仅有125个。可见小麦miRNA的鉴定尚有待进一步研究。为完善小麦miRNA的鉴定工作,探讨miRNA在冬小麦生长发育过程中的调节作用,我们以冬小麦“石麦22为实验材料,对三叶期、越冬期、返青期和花原基分化期四个时期的小麦叶片和茎尖分生组织,共8个材料中的小RNA(sRNA)进行研究。主要研究结果如下:(1)通过与miRBase数据库中的所有植物miRNA进行比较,鉴定出373个已知miRNA隶属于289个miRNA家族。被子植物中高度保守的23个miRNA家族(miR156/157、miR159、miR160、miR161、miR162、miR164、miR165/166、miR167、miR168、miR169、miR170/171、miR172、miR319、miR390、miR391、miR393、miR394、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408)和单子叶植物特有的miR444全部被检测到。(2)依据miRNA的鉴定标准,本研究鉴定出82个novel miRNA。依据序列的同源性,发现其中38个在相关文献中已经报道过,但是相关序列并没有存储到miRBase中,因此本研究首次发现novel miRNA 44个。(3)在叶片中筛选出差异表达已知miRNA 45个,novel miRNA 31个。其中miR9662a-3p和novel miR2079在三叶期丰度较高;miR156a-5p、miR165a-3p、miR5200-5p、miR9778以及novel miR1419在越冬期丰度较高;miR172a-5p、miR172e-3p、miR167a、miR408d、miR528-5p、miR9672b、novel miR1154以及novel miR1875在花原基分化期丰度较高。在茎尖分生组织中筛选差异表达已知miRNA 50个,novel miRNA 35个。其中miR9662a-3p、novel miR30以及novel miR1372在三叶期丰度较高;miR156a-5p、miR167a、miR5200-5p、miR9675-3p以及miR9778在越冬期丰度较高;miR172a-5p、miR172e-3p、miR394a以及miR9672b在花原基分化期丰度较高。表明这些差异表达的miRNA在不同时期不同组织的主导作用,这与之前的文献报道miR156和miR5200-5p抑制小麦开花,miR172和miR408促进小麦的开花。(4)对小麦所有miRNA的靶基因进行预测,得到了224个已知miRNA和48个novel miRNA的靶基因。对15个预测的靶基因采用RLM-5′RACE方法进行验证,其中10个靶基因得到了验证,其中包括两个高度保守的miRNA靶基因,TRIAES42AL72660A1524550.1(scarecrow-like protein)是miR171a-3p的靶基因,TRIAES42AL97448A0324210.1(AP2-like ethylene-responsive Factor)是miR172e-3p的靶基因。四个小麦物种特有的miRNA的靶基因也得到了验证,TRIAES42BS23630A1380910.2(putative disease resistance protein)是miR1127a的靶基因,TRIAES42DL43545A1136340.2(vulgare mRNA for predicted protein)是miR5181的靶基因,TRIAES42DS42718A1728780.1(transcription termination factor)是miR9662a-3p的靶基因,TRIAES42BS13439A1641660.1(protein Release fact