产肠毒素大肠杆菌F4和F18菌毛黏附素可溶性表达及发酵条件的优化

作     者：刘文亭 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭健

授予年度：2016年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：ETEC 仔猪腹泻 菌毛黏附素 大肠杆菌表达系统 分子伴侣 发酵优化 

摘      要：产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic ***,ETEC)所引起的仔猪腹泻率高达30%～50%,给养殖生产造成了巨大的经济损失。ETEC主要通过菌毛黏附素定植在肠道表面,通过释放肠毒素,引起仔猪脱水性腹泻,菌毛黏附素与肠上皮细胞的特异性结合是致病的首要因素。F4和F18是导致仔猪腹泻的主要ETEC菌株,其黏附素FaeG和FedF在定植中发挥着主要作用。菌毛黏附素主要由蛋白质组成,具有良好的免疫原性。有研究表明,通过体外表达ETEC菌毛黏附素来免疫仔猪,对预防致病菌引起的腹泻具有良好的效果。本研究主要通过构建黏附素与分子伴侣GroEL/GroES共表达体系来获得黏附素的可溶性表达,进一步优化发酵条件来提高黏附素可溶性表达产量,为规模化制备有活性的黏附素抗原提供可能,并探讨重组黏附素蛋白的免疫原性及制备的多克隆抗体的特异性。第一部分F4和F18黏附素与分子伴侣GroEL/GroES共表达载体构建结果如下:以F4ac标准菌株C8371及F18ac标准菌株2134P为试验材料,将PCR扩增得到的FaeG1-262序列及主要参与黏附过程的FedF15-165序列构建于pET表达载体上,将表达载体与分子伴侣GroEL/GroES载体pGro7共转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,经Western blotting检测,共表达体系成功表达了目的蛋白。通过对共表达体系与单独表达体系蛋白表达水平的比较发现,FaeG蛋白可溶性表达水平提高了 18%,包涵体表达量减少44%;FedF蛋白可溶性表达水平提高了 58%,包涵体表达量无明显差异,由此可见共表达体系提高了 FaeG和FedF蛋白的可溶性表达水平。黏附素蛋白带有6*HIS标签,以此进行镍亲和层析纯化,获得了纯度高达90%的黏附素蛋白,为后续免疫试验提供了良好的抗原。对纯化的蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析,结果显示,表达的FaeG和FedF蛋白氨基酸序列与天然蛋白序列分别达到72.5%和69.5%的一致性,对纯化蛋白进行圆二色谱分析表明,黏附素蛋白形成了正确的蛋白空间构象。第二部分重组工程菌可溶性表达发酵条件优化结果如下:1、对种龄、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度、L-阿拉伯糖诱导浓度进行单因素优化。通过分析各因素水平对菌体生长的影响,结合Quantity one4.6.2软件分析破碎菌体液SDS-PAGE电泳条带,计算黏附素蛋白可溶性表达量的灰度值,对不同条件下目的蛋白可溶性表达量进行相对比较,选择各因素最佳水平。优化结果如下,BL21(FaeG)菌株最适种龄为10h,诱导时间24h,诱导温度18℃,IPTG诱导浓度0.3mmol/L,L-阿拉伯糖诱导浓度0.8g/L,目的蛋白上清中浓度达到37.3mg/L,比未优化前(4.4mg/L)提高了 8倍。BL21(FedF)菌株最适种龄为1Oh,诱导时间24h,诱导温度1 8℃,IPTG诱导浓度0.1mmol/L,L-阿拉伯糖诱导浓度0.8g/L,目的蛋白上清中浓度达到12.2mg/L,而未优化上清中几乎无目的蛋白。2、通过单因素试验筛选适合的碳源、氮源种类及适合的添加浓度以及最佳的磷酸盐浓度。分析方法同可溶性发酵条件优化试验,最终得到BL21(FaeG)最适培养基成分为葡萄糖10g/L、酵母粉18g/L、蛋白胨9g/L、磷酸二氢钾72mmol/L磷酸氢二钾17mmol/L,FaeG蛋白优化后可溶性表达量达到60.36mg/L,比优化前(41.26mg/L)提高了 1.46倍。BL21(FedF)最适培养基成分为葡萄糖30g/L、酵母粉12g/L、蛋白胨6g/L、磷酸二氢钾36mmol/L、磷酸氢二钾8.5mmol/L,FedF蛋白优化后可溶性表达量达到21.78mg/L比优化前(15.9mg/L)提高了 1.37倍。3、以摇瓶发酵优化结果为基础,采用变速补料的方式对重组工程菌进行高密度发酵培养,根据菌体生长的阶段性,流加不同浓度的葡萄糖,保持培养基中低残糖浓度(3g/L),通过控制通气量及转速保证溶氧水平维持在30%左右。最终菌体浓度均达到12g(DCW)/L以上,FaeG蛋白可溶性表达量达到536mg/L,FedF蛋白可溶性表达量达到357mg/L,分别比摇瓶水平提高了 9倍和15倍。第三部分多克隆抗体制备结果如下:以纯化的黏附素蛋白为抗原免疫新西兰雄兔,四次免疫后收集血清,采用间接ELISA的方法测定血清效价。以FaeG蛋白为抗原的血清效价达到1:320000,以FedF蛋白为抗原的血清效价达到1:40000,表明获得的两种多克隆抗体均具有很高的抗体效价。通过免疫印迹的方法来检测该血清抗体的特异性,分析表明,免疫阳性血清在目的蛋白处形成明显条带,而免疫前阴性血清未出现条带,证明FaeG和FedF重组蛋