56种酚类抗氧化剂的RAF机制：实验证据与分析

作     者：谢雨露 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李熙灿

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：酚性抗氧化剂 DPPH·自由基 RAF机制 共轭体系 连接位点 

摘      要：目的:酚类抗氧化剂(尤其是中药中的酚类抗氧化剂)通过多种化学机制清除自由基,释放细胞的氧化应激。自由基加合(RAF)是其中的一种化学机制之一。目前,其RAF抗氧化机制仅停留在量子化学的理论研究,缺乏实验证据。所以,RAF抗氧化机制的规律尚不清楚。本文借助UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS的手段分析了 56种酚类抗氧化剂与DPPH·自由基反应的生成产物,进一步解析其质谱信息,来研究此类反应可能的机制,从而推断此类反应的一般规律。方法:本文选用56种酚类抗氧化剂:包括单苯环酚(如6-姜酚)、双苯环酚(如厚朴酚),以清除DPPH·自由基为模型,将自由基与抗氧化剂按照不同的比例反应12小时,将反应液稀释20倍,放入进样瓶中,借助UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS对其反应液进行分离并解析。根据质谱碎片离子裂解规律,分析其生成的产物,推断该反应可能的发生的RAF机制。结果:1.溶剂影响没食子酸不同的溶剂中(甲醇和丙酮),其二聚产物的质谱裂解图不同;这样的情况,同样出现3-methoxybenzene-1,2-diol与DPPH反应过程中(加合物的质谱裂解图不同)。相比于甲醇,在丙酮体系中的反应产物,在UPLC-MS色谱图上更容易检测到加合、二聚峰。2.单苯环体系除了邻苯二酚和对苯二酚,单苯环酚类都能在UPLC-MS的色谱图上检测到加合、二聚峰。一般来说,苯酚的加合、二聚峰数目多于苯二酚和苯三酚。其中苯酚二聚物的保留时间和质谱裂解规律跟2,2’-联苯二酚的单体相似;胡椒酚二聚物的保留时间和质谱裂解规律跟厚朴酚的单体相似。3.双苯环体系双苯环酚类跟DPPH·自由基反应时,生成的加合、二聚峰数目很多。比如说,2,2’-联苯二酚的加合、二聚峰数目多于4,4’-联苯二酚加合、二聚峰数目。氧化白藜芦醇、氧化白藜芦醇-3’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和桑皮苷A都能提取到加合、二聚峰,不过,三者的峰面积相差很大,其峰面积大小:氧化白藜芦醇氧化白藜芦醇-3’-0-β-D-吡喃葡萄糖苷桑皮苷A。白皮杉醇和白皮杉醇葡萄糖苷都能提取到加合、二聚峰,白皮杉醇的峰面积比白皮杉醇葡萄糖苷少,类似的还有土大黄苷元和土大黄苷。但白藜芦醇、ε-viniferin和α-viniferin都能提取到加合、二聚峰,但随着分子量的增加,生成二聚物的峰面积减少。检测到的二氢白藜芦醇和白藜芦醇都能提取到加合、二聚峰,但二氢白藜芦醇色谱峰数目低于白藜芦醇。四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去氧基姜黄素都能提取到加合、二聚峰,但四氢姜黄素生成的加合产物的量比较少,没有出现二级质谱图。结论:1.溶剂影响:酚类抗氧化剂清除DPPH·自由基时,溶剂会影响其生成产物的稳定性和裂解规律。***产物类型:酚类抗氧化剂和DPPH·自由基的加合反应;酚类抗氧化剂与酚类抗氧化剂发生的二聚反应。3.酚羟基数目的影响:在单苯环体系的酚性物质中,单羟基苯酚与DPPH·自由基反应速率要慢,相比二羟基、三羟基苯酚来说,但其生成的产物峰数目很多。此现象可解释为酚性物质与DPPH·自由基反应,首先发生脱氢反应,形成醌类物质,其中醌类化合物的稳定性强于半醌类化合物。4.苯环数目的影响:(1)单苯环:单环酚清除自由基时,可以生成二聚产物;当单环酚大大过量时,还可能生成三聚、四聚产物。单环酚形成加合产物峰数目主要是跟反应产物的比例、酚羟基的邻位和对位有无取代基有关。(2)双苯环体系的酚性物质因其结构比较复杂,其发生RAF机制可能跟多方面有关,如酚性化合物共轭体系。5.连接位点:以DPPH·自由基为例,加合反应的连接方式主要是N-C相连和N-0相连;二聚反应的连接方式主要是C-C相连和C-0相连。单环酚二聚时,至少可以在-OH邻位连接。