“紫芸解毒止痛酊”（ZYD）的物质基础及促再生修复作用机制初步研究

作     者：韦乐华 

作者单位：西南交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：茆灿泉

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：紫芸解毒止痛酊 皮肤创伤 再生修复 骨髓间充质干细胞 民族医药 

摘      要：皮肤创伤疾病,是生命医学领域中常见的最重要的疾病之一。由于被尖物、锐器所伤,皮肤会产生不同程度的损伤,若无良好药物治疗,则治疗恢复过程会很缓慢,甚至会留下不可恢复的疤痕。目前对于皮肤问题的越来越关注,亟需寻求一款对皮肤创伤的再生修复有显著治疗效果的药物,且安全、稳定和低毒副作用。随着科技的发展,国家对中医药高度重视,在科研创新投入很多资金和精力,试图攻克此难题,开发出更多安全有效的治疗药物。紫芸解毒止痛酊(ZYD)是由云南民族医药研究所股份有限公司及其控股子公司云南普洱丹州制药股份有限公司联合多家科研院所开发的一款多功能中药医院制剂,前期研究发现,其具有抑菌镇痛、抗糖尿病足溃疡以及抑制炎症反应等多种生物学功效,但对其药效物质基础、促皮肤再生修复机制尚不清楚,本课题就以下几方面进行了较深入的研究。首先,为了确保中草药植物原材料的安全、稳定、可靠,对采集的宽叶金粟兰、天蓬子、黄连、野菊花四种重要药材进行DNA水平的分子鉴定。以基因组DNA为模板,PCR扩增其ITS2和psbA-trnH序列,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序,分析四种药材的ITS2序列和psbA-trnH序列与数据库中其近缘、易混物种之间的序列差异。结果表明,实验药材在ITS2进化树中与同类物种分别聚类为同一支,通过在线数据库分析其与近缘物种的ITS2和psbA-trnH条形码序列之间的序列差异,数据库鉴定结果与ITS2进化树分析结果一致,即成功鉴定四种药材为真品。其次,利用CCK-8法在体外探究ZYD、相关植物提取液及其功效成分对小鼠成纤维瘤细胞L929和BMSCs的作用影响及其可能的物质基础。结果显示,4.0%浓度的ZYD对L929细胞增殖的相对抑制率可达90%左右(P0.05);低浓度羟基红花黄色素A与尿囊素对BMSCs细胞具有显著促增殖作用(P0.05),各组之间的肝脾指数均无显著性差异(P0.05)。通过ELISA法检测小鼠血清,发现第10 d ZYD组小鼠血清中EGF因子表达上调,显著高于模型组(P0.05)。HE染色结果发现,ZYD组表皮明显增厚,可见大量成纤维细胞聚集和胶原纤维增生明显,第16 d胶原纤维走形规则,各层结构恢复比模型组好。IHC免疫组化分析,发现第10 d小鼠伤口皮肤组织EGF和TGF-β1的表达较模型组均显著上调,与血清检测的EGF显著上调结果一致。通过Western Bloting定量分析,进一步确认了组织中TGF-β1蛋白表达上调,与免疫组化的结果一致。揭示ZYD对皮肤创伤再生修复作用的分子机制,可能与其促进EGF和TGF-β1因子的表达密切相关。最后,利用HPLC法测定了5个批次的紫芸解毒止痛酊中5种抗炎修复相关功效成分,结果显示,P15批次中羟基红花黄色素A的含量依次为23.72±0.44、24.49±0.15、25.23±0.51、23.52±0.21、23.44±0.42μg·mL,尿囊素含量依次为172.96±1.11、142.62±2.42、146.46±0.78、138.02±0.40、127.24±1.86μg·mL;5个批次的ZYD中尿囊素与羟基红花黄色素A的含量稳定,与本课题体外细胞作用物质基础研究得到的结果相印证。综上,通过DNA条形码技术鉴定了中药材宽叶金粟兰、天蓬子、黄连和野菊花的来源是安全可靠的;体外细胞实验表明,ZYD对L929细胞的抑制作用的物质基础可能与羟基红花黄色素A、左旋紫草素、尿囊素、薯蓣皂苷元和左旋龙脑五种功效成分有关,而ZYD、红花提取液对BMSCs促增殖作用的物质基础可能与红花中的羟基红花黄色素A有关;体内动物实验结果表明,ZYD可通过调控EGF和TGF