草鱼肿瘤坏死因子配体15（TNFSF15/TL1A）及其受体25（TNFRSF25）的进化与表达分析

作     者：程星星 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹钧

授予年度：2019年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：肿瘤坏死因子超家族 草鱼 进化 感染 表达 重组蛋白 

摘      要：肿瘤坏死因子配体(TNFSF)和受体(TNFRSF)超家族在机体免疫炎症,增殖分化和造血功能中发挥着多种作用。迄今为止,在人类中已经鉴定出19种配体超家族和29种受体超家族成员;在硬骨鱼中先后鉴定出14种配体超家族成员。TNFSF15/TL1A基因是在2002年由Migone等人首次报道,是由四个外显子和三个内含子组成。TNFRSF25(又名DR3、Wsl-1、TR3、Apo-3、TRAMP、TNFRSF12)是在1996年由Kitson等人在人类基因组中挖掘与TNFR1同源并含有死亡结构域的序列时被首次报道。草鱼在我国养殖历史悠久,是最重要的经济鱼类。然而,我国养殖产业一直备受草鱼疾病的困扰。研究草鱼免疫炎症无论是对实际生产养殖还是对免疫理论的发展都有重要意义。本研究克隆了草鱼TNFSF15/TL1A及TNFRSF25基因,分析其序列。并用柱状黄杆菌(***)和草鱼出血病病毒(GCRV)对健康的草鱼进行感染,检测TNFSF15/TL1A及TNFRSF25基因在草鱼不同组织中的表达情况。利用大肠杆菌原核表达技术表达并纯化了目的基因的重组蛋白。取得了以下成果:1.分别克隆鉴定了草鱼TNFSF15/TL1A和TNFRSF25基因。分析表明:草鱼TNFSF15/TL1A的cDNA全长为1095 bp,其中723 bp的开放阅读框编码240个氨基酸,其蛋白序列中含有一段TM(36-58 aa)和THD(98-237 aa);草鱼TNFRSF25的cDNA全长为1420 bp,其中1152 bp的开放阅读框编码383个氨基酸,其蛋白序列中含有一段N端信号肽(1-22 aa),一个TM(173-195 aa)和DD(291-371 aa)。进一步分析显示:草鱼TNFRSF25基因是硬骨鱼类TNFRSF1A-like的直系同源基因,并且与哺乳动物的TNFRSF25基因具有较好的基因共线性关系。2.实时荧光定量结果显示:TNFSF15/TL1A和TNFRSF25基因在草鱼的脑、皮肤、鳃、肠、胸腺、体肾、肝脏、头肾和脾脏中呈组成型表达。***和GCRV对草鱼TNFSF15/TL1A和TNFRSF25基因的表达具有调控作用。在头肾和脾脏中当腹腔注射1×10 cfu/mL的*** 24 h时草鱼TNFSF15/TL1A和TNFRSF25的mRNA表达量均出现显著下调。3.分别表达并纯化了草鱼TNFSF15/TL1A(24 KDa)及TNFRSF25(19 KDa)的重组蛋白。蛋白活性实验结果表明:在与原代肾脏细胞共孵育24 h时,重组的草鱼TNFSF15/TL1A蛋白可以调控草鱼TNFRSF25、c-IAP、IL-1β、IFN-γ、Caspase-7及TNF-α基因的表达。