资木瓜总苷通过MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径产生RA关节镇痛作用

作     者：董甜甜 

作者单位：三峡大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李世刚

授予年度：2019年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：类风湿关节炎 资木瓜总苷 肥大细胞 背根神经节神经细胞 镇痛 

摘      要：目的:研究资木瓜总苷通过抑制肥大细胞活化,减少炎性因子产生,从而减轻对背根神经节神经细胞的活化作用,达到对类风湿关节炎（RA）关节镇痛的作用。方法:（1）小鼠骨髓来源肥大细胞（m BMMC）的培养及鉴定:分离提取C57BL/6小鼠骨髓来源的细胞,诱导分化培养4周后,进行TB染色和电镜观察,鉴定为m BMMC。（2）小鼠背根神经节神经细胞（DRGn）的培养及鉴定:分离提取C57BL/6小鼠的脊髓背根神经节,酶解消化成单细胞后培养1周,进行免疫细胞化学和免疫荧光鉴定为DRGn。（3）CCK-8和MTT法检测不同浓度资木瓜总苷对m BMMC、RBL-2H3细胞和DRGn的毒性作用。（4）β-氨基己糖苷酶（β-Hexosaminidase）法检测m BMMC和RBL-2H3细胞活化脱颗粒情况。（5）建立共培养体系:组胺标准品与DRGn共培养,m BMMC与DRGn共培养,分别加入H1受体拮抗剂和TRPA1拮抗剂。（6）ELISA检测肥大细胞培养液中组胺（Histamine）含量、共培养体系中P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）含量。（7）Western blot检测DRGn的PLC-γ1蛋白和TRPA1蛋白的表达。结果:（1）经过鉴定,所提取培养的原代m BMMC和DRGn纯度均达到90%以上。（2）细胞毒性检测,资木瓜总苷浓度在0.01-0.32mg/ml之间时对m BMMC、RBL-2H3细胞和DRGn几乎无毒性。（3）资木瓜总苷可显著降低经化合物C48/80刺激m BMMC和RBL-2H3细胞释放的β-Hexosaminidase的释放率（P0.01）。（4）资木瓜总苷可显著抑制m BMMC和RBL-2H3细胞释放Histamine的含量（P0.01）。（5）在组胺标准品与DRGn共培养中,随着Histamine浓度的增高,DRGn释放的神经肽SP也随之增高,而加入H1受体拮抗剂后,SP相应地减少（P0.05）。（6）在m BMMC与DRGn共培养体系中,分别加入资木瓜总苷、H1受体拮抗剂和TRPA1拮抗剂处理12h后,SP和CGRP的含量相应地减少,PLC-γ1和TRPA1蛋白表达量也减少（P0.05）。结论:（1）资木瓜总苷浓度在0.01-0.32mg/ml之间对m BMMC的存活无影响,且随着药物浓度增高抑制肥大细胞活化脱颗粒。（2）Histamine能通过HR1呈浓度依赖性地引起DRGn释放SP。（3）资木瓜总苷可能是通过抑制MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径发挥类风湿关节炎镇痛作用。