基于MRP-氧化应激的芦荟大黄素对老年小鼠肝肾毒性机制研究
作者单位:成都中医药大学
学位级别:硕士
导师姓名:曾勇
授予年度:2019年
学科分类:1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要:目的本实验以芦荟大黄素为研究对象,运用D-gal溶液建立衰老模型小鼠,探讨其对老年小鼠的肝肾毒性及相关机制。从“剂量-年龄两个层面出发,围绕MRP外排蛋白、氧化应激能力、线粒体功能、细胞凋亡等几个方面,探讨芦荟大黄素对老年小鼠肝肾毒性的机制。为临床安全使用含蒽醌类物质的中药提供科学依据。方法SPF级6周龄小鼠30只,雌雄各半。25周后,小鼠颈背部皮下注射2.5%D-半乳糖溶液,0.05 mL/10 g,连续给药60 d。将建立成功的衰老模型小鼠按体重随机分为3组:老年对照组(D-gal)、老年芦荟大黄素低(D-gal+AE-L)、高剂量组(D-gal+AE-H)。将30只SPF级6周龄小鼠随机分为3组:青年对照组(Control)、青年芦荟大黄素低(AE-L)、高剂量组(AE-H)。青年和老年低剂量组小鼠灌胃芦荟大黄素0.8 g/kg,青年和老年高剂量组小鼠灌胃芦荟大黄素1.6g/kg,每天早晚各一次,连续给药75 d。1.衰老小鼠模型鉴定:运用流式细胞术方法,检测分析胸腺T细胞表面CD/CD和CD蛋白的变化;2.芦荟大黄素对老年小鼠肝脏和肾脏毒性检测:采用生物化学法检测小鼠血液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活力、肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量,采用苏木素-伊红(HE)染色检测肝脏和肾脏细胞形态学变化;3.芦荟大黄素对老年小鼠MRP蛋白表达的影响:采用免疫印迹法(Western Blot)检测肝脏组织中MRP1和MRP2蛋白的表达;4.芦荟大黄素对老年小鼠氧化应激的影响:生物化学法检测血液中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量,肝脏和肾脏中还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比值和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力;5.芦荟大黄素对老年小鼠线粒体功能及细胞凋亡的影响:流式细胞术检测肝脏线粒体膜电位(MMP)和肝脏线粒体内Ca肿胀度,免疫组化法检测肝脏天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和肾脏caspase-3和TGF-β的表达。结果:1.衰老模型的评价D-半乳糖连续给药60 d后,与青年组比,老年组小鼠体重增加缓慢、饮食减少、行动迟缓、皮毛稀疏无光泽并且面部毛发脱落,出现衰老体征。老年组小鼠胸腺T细胞表面CD、CD和CD分子及CD/CD比例显著降低(P0.05);与老年对照组比,低、高剂量组MRP1和MRP2蛋白表达有降低趋势,且老年高剂量组的MRP1蛋白表达显著降低(P0.05)。4.芦荟大黄素对小鼠氧化应激的影响与青年对照组比,低、高剂量组SOD活力明显降低(P0.05),MDA含量明显升高(P0.01),与老年对照