Wnt通路在力加重牙周组织破坏中作用的研究

作     者：张聪聪 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王永兰

授予年度：2019年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周炎 咬合创伤 单轴循环拉伸应变 Wnt通路 

摘      要：目的:通过牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides,P.g LPS)及与一定频率大小的单轴循环拉伸应变(2500u,0.5Hz)协同作用于体外培养的人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligment fibroblasts,h PDLFs),观察分析经典Wnt通路分子β-连环蛋白(β-catenin)、非经典Wnt通路分子Wnt5a、受体酪氨酸激酶样的孤独受体2(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,Ror2)和促进骨形成的关键调控因子核心结合蛋白因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)m RNA和蛋白的变化情况,初步探讨Wnt通路在炎症与力协同作用时骨吸收机制中可能起的作用,为进一步探究咬合创伤加重牙周炎时牙周组织破坏提供理论依据。方法:1.经天津医科大学口腔医院伦理委员会批准(TMUh MEC2018104),选择就诊于天津医科大学口腔医院颌面外科因正畸要求拔除的12-16岁健康双尖牙,酶消化法培养人牙周膜成纤维细胞,免疫组化方法鉴定细胞来源。***-PCR法检测力学微环境下h PDLFs和炎性h PDLFs中β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA随时间推移的表达变化情况,观察目的分子m RNA表达峰值或谷值出现的时间点,即最佳加力时长;用RT-PCR法和Western blot法检测在该加力时长时P.g LPS组(P组)、单轴循环拉伸应变组(S组)以及二者协同作用组(P+S组)h PDLFs中β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2表达的变化情况。结果:1.采用酶消化法能够在体外成功培养出人牙周膜成纤维细胞。免疫组织化学结果显示细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,证明为中胚层来源的人牙周膜成纤维细胞。***-PCR结果显示,随时间推移,无论是单纯加力组,还是P.g LPS与力共同作用组,在本实验所选的几个时间点,即从0.5h到2h到4h,β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA的表达均经历了先升高后降低或先降低后升高的变化趋势,确定2h为最佳加力时长。RT-PCR和Western blot结果显示,当加力时长确定为2h时,与C组相比,P组β-catenin表达增加(PCR:P0.05),Runx2表达下降(P0.05),Ror2表达增加(P0.05)。与P组相比,P+S组β-catenin、Runx2、Wnt5a表达下降(P0.05),Ror2表达增加(P0.05)。结论:1.选择符合纳入标准的健康双尖牙,采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞,短期内即获得大量纯度较高的实验细胞,细胞生长代谢旺盛,对干预反应良好,满足实验需要。培养过程中注意无菌操作,取材部位严格,刮取组织力度适当,以及消化时间的控制是确保牙周膜成纤维细胞培养成功的关键。2.随施力时间加长,经或未经P.g LPS处理的人牙周膜成纤维细胞,Wnt通路相关分子包括β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA的表达均经历了先升高后降低或先降低后升高的变化趋势,表示两种微环境下的牙周膜成纤维细胞在受到牵张力后的应激过程中,经典和非经典Wnt通路可能均起了一定的作用。单轴循环拉伸应变可激活经典Wnt/β-catenin通路和非经典Wnt5a/Ror2通路,P.g LPS同样激活Wnt5a/Ror2通路,而Runx2表达变化却完全相反,表明Wnt通路在不同微环境下激活可能会有成骨或破骨截然相反的效应,具体机制尚需进一步研究;二者协同作用时激活Ror2相关的非经典Wnt通路,而经典Wnt通路受到一定程度抑制,Runx2表达量最低,这些可能与机械力加重炎性牙周组织骨破坏有关。为咬合创伤加重未经控制的牙周炎患者的骨吸收提供理论依据。