一、激酶NLK通过磷酸化Smad2/3链接区抑制TGF-β信号通路 二、ARID2敲除对肝癌细胞Hep3B增殖的影响及其转录组分析

作     者：周彦池 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：赵宏

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：NLK 磷酸化 Smad2/3 TGF-β信号通路 肝肿瘤 ARID2 Hep3B CRISPR/Cas9 RNA-seq 

摘      要：(一)激酶NLK通过磷酸化Smad2/3链接区抑制TGF-β信号通路TGF-β信号通路参与细胞凋亡、细胞增殖、上皮间质转化、血管形成、免疫应答等多种生物学过程的调控。作为TGF-β信号发挥功能的胞内效应分子,Smad2/3的活性受到胞外信号和胞内因子的精细调控。通过CRISPR-Cas9高通量筛选,我们发现敲除NLK基因能够提高Ser465/Ser467磷酸化Smad2的表达,提示激酶NLK可能参与TGF-β信号通路的调控。我们发现过表达NLK能够明显抑制Smad2/3介导的转录反应,进而抑制TGF-β介导的细胞迁移;而降低细胞内NLK的表达能够增强Smad2/3介导的转录反应以及TGF-β介导的细胞生长阻滞和细胞迁移。免疫共沉淀实验结果显示,NLK能够与Smad2/3结合。体外激酶实验发现,NLK能够磷酸化Smad3链接区208位的丝氨酸和Smad2链接区250位的丝氨酸。与此一致,在细胞内过表达NLK,Smad2/3的链接区磷酸化水平明显升高,而Smad2/3 C端磷酸化水平和总Smad2/3表达水平明显降低;而降低NLK的表达,Smad2/3链接区相应位点的磷酸化水平则明显降低,Smad2/3 C端磷酸化水平和总Smad2/3表达水平明显升高。放线菌酮处理细胞检测Smad2/3蛋白稳定性发现,Smad2/3链接区磷酸化可以降低Smad2/3的蛋白质稳定性。我们的结果首次揭示,NLK能够通过磷酸化Smad2/3的链接区降低Smad2/3活性,从而抑制TGF-β信号通路。（二）ARID2敲除对肝癌细胞HeP3B增殖的影响及其转录组分析目的 利用CRISPR/Cas9技术构建ARID2敲除的人肝癌细胞系Hep3B,并探究ARID2敲除对细胞增殖的影响以及敲除细胞与野生型Hep3B细胞间基因表达的差异。方法 构建ARID2敲除的lentiCRISPRv2质粒,转染Hep3B细胞,嘌呤霉素筛选后通过流式细胞仪分选单细胞,并培养获得单克隆细胞株;通过Western blotting和Sanger测序鉴定ARID2敲除细胞株;通过CCK-8实验检测ARID2敲除对Hep3B细胞增殖的影响;通过RNA-seq分析差异表达基因,并通过实时定量PCR（RT-qPCR）技术进行验证。通过京都基因与基因组百科全书数据库通路注释（KEGG Pathway）、基因本体生物学过程（GO Biological Processes）富集分析以及基因集富集分析（GSEA）分析ARID可能参与的生物学功能。结果 成功构建两株ARID2敲除的Hep3B人肝癌细胞系。与野生型Hep3B细胞相比,ARID2敲除细胞增殖明显加快（P0.05）。RNA-seq分析共检测到85个差异表达基因,其中17个基因上调,68个基因下调。通过RT-qPCR对其中10个差异表达基因进行验证,验证结果与RNA-seq结果一致。KEGG Pathway,GO Biological Processes富集分析以及GSEA结果表明,ARID2基因与蛋白质的加工及转运、趋化因子信号通路、Wnt信号通路、补体与凝血级联反应、上皮皮间质转化（EMT）、糖酵解、TGF-β信号通路、TNF-α/NF-κB信号通路等生物学过程相关。结论ARID2敲除可以促进Hep3B细胞系的增殖;ARID可能通过多种生物学过程,对肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等表型以及肿瘤微环境产生影响。