双酚A通过生物钟基因Nr1d1影响睾酮合成的机制研究
作者单位：西北农林科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈华涛
授予年度：2019年
学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学]
摘 要：生物钟作为生命体中一种重要的调控系统,对机体的分子、细胞、生理、生化等各层次的生理功能均起到重要的调节作用。有研究表明在大鼠卵巢颗粒细胞,生物钟基因Nr1d1激动剂会以剂量依赖的方式显著增加StAR的mRNA达量;而且生物钟基因在小鼠睾丸间质细胞中存在节律性表达并参与调控小鼠睾酮的合成。双酚基丙烷又称双酚A(Bisphenol A,BPA),是一种重要的工业化合物,常用于生活日用品的制造。其作为一种环境内分泌干扰物,可以通过呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体。已有研究证明BPA能够对人和动物的生殖系统产生潜在的影响,并且会影响雄性睾酮的分泌,但具体的分子机制仍不清楚,亟待进一步深入研究。此外有证据显示,暴露于BPA对小鼠神经元细胞的生物钟基因表达有显著影响。综上,我们推测BPA、生物钟与睾酮合成三者之间应该存在一定的联系,因此,本研究对BPA是否通过生物钟来影响睾酮合成的分子机制进行了探究。本研究主要利用小鼠睾丸间质细胞系(TM3)、原代睾丸间质细胞以及小鼠睾丸等体内、体外模型,借助Kronos AB-2550实时生物节律荧光检测系统、RT-qPCR、Western blotting、ELISA、流式细胞术等多种细胞生物学、分子生物学技术,探究BPA通过生物钟影响小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的分子机制。研究结果如下:1.通过CCK8和流式细胞术筛选出对TM3细胞增殖和凋亡无显著性影响的最适BPA处理浓度为10μΜ;然后,采用RT-qPCR、Western blotting、ELISA、Kronos AB-2550实时生物节律荧光检测系统探究10μΜBPA处理对TM3细胞及小鼠原代睾丸间质细胞生物钟系统的影响,同时检测了BPA对TM3细胞睾酮合成关键酶基因表达和细胞培养上清液睾酮含量的影响。结果表明10μΜBPA会影响小鼠睾丸间质细胞生物钟系统,显著降低了生物钟基因Nr1d1的mRNA及蛋白表达;此外,BPA处理会显著降低睾酮合成通路关键酶基因mRNA和蛋白的表达,降低TM3细胞培养上清液中睾酮含量。综上可知,BPA处理会从细胞水平影响小鼠睾丸间质细胞的生物钟系统及睾酮合成关键酶基因的表达,从而抑制睾酮的合成。2.为了检测BPA对小鼠在体睾丸生物钟和睾酮合成关键酶的影响,我们以80μM/kg*d的剂量采用腹腔注射的方式连续注射7 d成功构建BPA处理小鼠模型,运用RT-qPCR、Western blotting、ELISA检测BPA处理后小鼠睾丸组织生物钟基因及睾酮合成关键酶基因在mRNA和蛋白水平的表达变化及小鼠血清睾酮含量的变化。结果发现,BPA处理组小鼠睾丸生物钟基因、睾酮合成关键酶基因及小鼠血清睾酮含量变化与细胞水平变化趋势一致。上述结果进一步从在体水平说明BPA暴露会影响小鼠睾丸生物钟及睾酮合成关键酶基因的表达,进而影响睾酮的合成。3.利用生物钟基因Nr1d1的激动剂SR9009以及Nr1d1 siRNA处理TM3细胞构建细胞模型,通过KronosAB-2550实时生物节律荧光检测系统、RT-qPCR、Western blotting和ELISA等技术来探究改变NR1D1活性对小鼠睾丸间质细胞生物钟和睾酮合成的影响。结果显示,作为NR1D1激动剂SR9009能造成TM3细胞生物钟系统紊乱,并且显著升高部分睾酮合成关键酶基因的表达,显著提高了TM3细胞培养上清液中睾酮含量。与此相反的是,干扰Nr1d1的TM3细胞中部分睾酮合成关键酶基因mRNA及蛋白表达量显著降低,且TM3细胞培养上清液中睾酮含量显著降低。上述结果表明生物钟基因Nr1d1正向参与调节睾丸间质细胞睾酮的合成。4.为了进一步探究BPA、生物钟基因Nr1d1以及睾酮合成三者之间的关系,我们设置了对照、BPA处理、BPA+SR9009处理三组分组,利用Kronos AB-2550实时生物节律荧光检测系统、RT-qPCR、Western blotting、ELISA等方法检测发现,生物钟基因Nr1d1的激动剂SR9009处理能显著恢复由BPA处理引起的生物钟基因、睾酮合成关键酶基因以及TM3细胞培养上清液中睾酮含量的变化趋势。因此我们推测BPA对TM3细胞睾酮合成的影响至少部分是通过生物钟基因Nr1d1通路来完成的。综上所述,研究结果表明,无论是在体内还是体外,BPA暴露都会影响睾丸及睾丸间质细胞的生物钟,生物钟基因Nr1d1在mRNA和蛋白表达水平均下降,进而引起睾酮合成通路关键酶基因mRNA及蛋白水平的下降,最终抑制睾酮的合成。本研究通过探讨BPA、生物钟以及睾酮合成三者之间的关系,阐明了BPA通过生物钟基因Nr1d1影响睾酮合成的分子机制,对揭示BPA乃至其他环境内分泌干扰物的的生殖毒性机制以及为人类寻找解决BPA损害雄性生殖力的方法提供前期理论基础。
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