二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究

作     者：谭俊杰 

作者单位：广西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄忠仕

授予年度：2019年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：阿尔兹海默病 二苯乙烯苷 NG108-15细胞 磷酸化Tau蛋白 蛋白磷酸激酶 蛋白磷酸酶 

摘      要：目的:本文采用冈田酸诱导的NG108-15细胞制备阿尔兹海默病细胞模型,通过检测二苯乙烯苷对诱导的NG108-15细胞中磷酸化的Tau蛋白以及相关磷酸激酶和磷酸酶、磷酸激酶调控因子表达的影响,探讨二苯乙烯苷对阿尔兹海默病细胞模型Tau蛋白磷酸化调控的影响及作用机制。方法:采用MTT法观察TSG作用于冈田酸诱导的NG108-15细胞24 h时的增殖情况,选取合适的剂量作为造模浓度。取对数生长期的NG108-15细胞,分为正常组、模型组、TSG低、中、高剂量(50、100、200μmol/L)组。利用AO/EB双荧光染色法检测TSG对细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸激酶蛋白CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK,磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白的表达。RT-PCR法检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B mRNA的变化。免疫荧光(Immunofluorescence)检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B和Tau蛋白表达和分布。采用SPSS软件对正常组、模型组和高、中、低给药组的Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白、磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β和磷酸酶蛋白PP2A、PP2B基因之间相关性进行分析。结果:在MTT实验中,NG108-15细胞随OA浓度升高,存活率下降,当浓度为80nmol/L时,细胞存活率下降明显(P0.01),细胞衰老皱缩,细胞形态学发生改变,AO/BE荧光染色显示细胞有凋亡产生。选取80nmol/L作为造模剂量,经给药后,TSG能够增强冈田酸诱导的NG108-15细胞的增殖能力,呈一定的剂量依赖;与模型组比较,TSG能抑制冈田酸对NG108-15细胞的衰老,提高细胞存活率(P0.05)。(1)TSG对OA诱导的NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中P-Tau的含量显著升高(P0.01),TSG给药后与模型组相比,中、高剂量组P-Tau含量下降(P0.01或P0.05),免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少Tau蛋白的聚集。结果提示,TSG降低OA诱导的NG108-15细胞的Tau磷酸化水平,减少Tau蛋白的聚集程度。(2)TSG对OA诱导的NG108-15细胞磷酸激酶的影响。Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白的表达显著升高(P0.01),TSG给药后与模型组相比,给药组磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA表达降低(P0.01或P0.05)。RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中CDK5和GSK3βmRNA的转录显著增多(P0.05或P0.01),TSG能显著下调OA诱导的NG108-15细胞CDK5和GSK3βmRNA的转录(P0.01)。免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少CDK5和GSK3β蛋白的表达。结果提示,TSG能降低磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA的表达,从而减轻Tau的磷酸化水平。(3)TSG对OA诱导的NG108-15细胞磷酸酶的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中磷酸酶PP2A、PP2B、PP5蛋白的含量显著下降(P0.01),TSG给药后与模型组相比,给药组磷酸酶PP2A、PP2B、PP5蛋白的含量显著增高(P0.01或P0.05),低剂量组中PP5蛋白含量无统计学差异。RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中PP2A和PP2B mRNA的转录显著下降(P0.05或P0.01),TSG能上调OA诱导的NG108-15细胞PP2A和PP2B mRNA的表达(P0.05或P0.01)。免疫荧光结果显示,与模型组相比,TSG给药组能提高PP2A和PP2B蛋白的表达。结果提示,TSG能提高磷酸酶的表达,增强P-Tau的去磷酸化水平。(4)TSG对OA诱导的NG108-15细胞磷酸激酶调控因子的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中P35蛋白的含量显著升高(P0.01),TSG给药后与模型组相比,给药组P35含量降低(P0.01)。结果提示,TSG能下调磷酸激酶调控因子的含量,从而减少Tau蛋白的磷酸化水平。结论:二苯乙烯苷能提高OA诱导NG108-15细胞的抗衰老能力和生存率,降低Tau蛋白的异常磷酸化水平。其机制可能是通过下调Tau蛋白相关的磷酸激酶CDK5、GSK3β、MAPK1、PKA、JNK、CK1及其调控因子P35,上调相关的磷酸酶PP2A、PP2B、PP5,调控其磷酸化与去磷酸化的平衡有关。