表层蛋白对乳杆菌益生性质的影响及其抑菌功能

作     者：牛钰涵 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卢蓉蓉

授予年度：2019年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：表层蛋白 乳杆菌 表面性质 黏附 联合抑菌 

摘      要：乳杆菌表层蛋白作为乳杆菌细胞壁外的一层特殊结构,已被证明具有保护菌体完整性和益生性质的作用。近年来,越来越多的研究开始关注表层蛋白自身的生物学功能如抗氧化作用、免疫功能以及抑菌作用等,但其对表层蛋白生物学功能的作用机制以及研究范围仍旧比较有限。本论文从表层蛋白对乳杆菌益生性质的影响开始研究,进一步探究纯化后表层蛋白的黏附、抗炎以及抑菌功能,旨在发现乳杆菌表层蛋白更多的生物学功能,为其进一步的研究和应用提供理论依据。首先通过提取和电泳鉴定筛选出7株携带表层蛋白的乳杆菌,*** NCFM、*** ATCC 4356、*** CGMCC 1.1878、*** CCFM 421、*** JCM 1101、*** JCM 2009、*** CCFM Y40。使用LiCl去除7株乳杆菌的表层蛋白后,菌株自聚率、表面电荷吸附率、与沙门氏菌共聚率相较完整菌株均显著下降(P0.05)。菌株疏水性除*** NCFM外均较完整菌株显著降低(P0.05),表明表层蛋白的存在对乳杆菌上述表面性质有积极作用。模拟胃肠道耐受实验发现,LiCl处理后的菌株在模拟胃肠环境中的存活率较完整菌株显著降低(P0.05),表明表层蛋白对胃肠道环境下的乳杆菌具有保护作用。乳杆菌黏附HT-29细胞实验结果显示,在去除表层蛋白之后,7种乳杆菌黏附率较之前均显著下降,其中*** NCFM下降最大,达到73.6%(P0.05)。纯化得到了4株乳杆菌的表层蛋白(*** NCFM、*** CGMCC1.1878、*** CCFM 421、*** 2009),发现4种表层蛋白在排除、竞争、替换三种处理方式下均可以显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌对HT-29细胞的黏附(P0.05),但不同方式的作用效果不同。表明表层蛋白可以通过与致病菌竞争黏附位点或掩盖干扰其识别黏附位点等方式拮抗致病菌对HT-29细胞的黏附。通过对大肠杆菌感染的HT-29细胞的细胞活力和IL-8分泌的测定,发现*** NCFM表层蛋白能够抑制大肠杆菌诱导的HT-29细胞的IL-8的上调,表明表层蛋白具有调节炎症和免疫反应的作用,能够调节炎症反应相关的IL-8促炎症因子。进一步探究表层蛋白对致病菌的抗菌作用,通过生长曲线和活菌计数证实*** NCFM和*** CGMCC 1.1878的表层蛋白具有提高Nisin抑制金黄色葡萄球菌抑菌活性的作用。Nisin单独或与表层蛋白联合处理时,可以观察到显著的膜透性变大以及A吸收物质的释放(P0.05)。此外,流式细胞仪检测结果表明Nisin与表层蛋白的联合抑菌机理涉及细胞内酶活力的降低,细胞膜损伤以及细胞膜电位的降低。未来可能通过二者的联合使用,解决Nisin的抗药性问题。综上,本论文研究发现携带表层蛋白对菌体表面性质、胃肠道耐受性以及黏附功能具有积极作用。纯化的表层蛋白能够拮抗致病菌黏附及调节致病菌诱导的细胞炎症反应。此外可与Nisin联合使用抑制***。研究显示了乳杆菌表层蛋白对菌株益生功能的贡献及自身抑菌和免疫调节方面的潜能,为其进一步的开发利用提供了基础数据。