大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子免疫学快速检测方法的研究

作     者：李燕虹 

作者单位：河南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张改平;古绍彬

授予年度：2019年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子 多克隆抗体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 胶体金免疫层析试纸 

摘      要：大豆是一种优良的植物蛋白资源,且必需氨基酸丰富平衡。但大豆中也含有多种抗营养因子和抗原蛋白,若加工或饲用不当,不仅会降低其自身营养,而且可能会对机体造成损害。胰蛋白酶抑制因子是大豆中一类重要的抗营养因子和抗原蛋白,不仅可诱发机体产生超敏反应,而且可和体内的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结合,抑制其活性,最终导致消化不良,阻碍生长发育。因此,对其进行检测研究尤为必要。大豆胰蛋白酶抑制因子主要可分为Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypisin inhibitor,KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk inhibitor,BBI),其中BBI性质稳定,不易失活去除。本研究以BBI做为免疫原,通过动物免疫及细胞融合等试验,获得免疫学特性良好的兔源多抗和鼠源单克隆抗体,基于两种不同来源的抗体,建立了BBI双抗体夹心ELISA检测方法,并基于单克隆抗体制备了BBI胶体金免疫层析试纸。(1)将BBI作为免疫原,对12周龄的新西兰大白兔进行免疫,免疫结束后心脏采血,对血液进行处理分离血清并纯化,获得BBI兔源多抗,抗体效价和敏感性鉴定结果表明,该抗体效价达到1:1.024×10,IC为306.76ng/mL。(2)将BBI作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经对鼠多抗血清鉴定,挑选多抗血清具有良好免疫学特性的小鼠进行细胞融合,然后筛选获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株3B7-B10、7G7-D11。体内诱生腹水法制备单抗后,对其免疫学特性进行鉴定,结果表明2株单抗效价均高于1:4.096×10,3B7-B10半数抑制浓度为83.07ng/mL,7G7-D11半数抑制浓度为186.81ng/mL,亚型均为IgG1型,3B7-B10亲和常数达到了1.13×10L/mol,交叉反应试验和免疫印迹试验表明2株单抗均具有很强的特异性。(3)基于兔源多抗和鼠源单抗3B7-B10,建立了BBI双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有较强的可靠性,标准曲线中BBI浓度与OD值线性关系良好,线性回归方程为y=1.3836x-1.9496,R=0.9795,线性范围为31.2000ng/mL,检测限为31.6ng/mL,添加回收率在81.38%00.75%,并具有良好的特异性。(4)基于所筛选的免疫学特性良好的鼠源单克隆抗体,结合胶体金免疫层析试纸技术,制备BBI胶体金免疫层析试纸,试纸目测检测限为0.5μg/mL,读条仪机读检测限为0.23μg/mL,对所制备试纸的准确度、特异性进行鉴定,结果表试纸检测性能良好,可用于BBI的快速检测。