驴肌内脂肪全基因组甲基化差异分析及相关基因的研究

作     者：刘迥 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾维斌

授予年度：2019年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：驴 肌内脂肪 DNA甲基化 PPARγ基因 LPL基因 

摘      要：目的:肌内脂肪含量(IMF)是影响肉品质的重要指标,对驴肌肉的脂肪沉积具有重要意义。其反应机理是复杂的生物学过程,受表观遗传修饰和相关基因的表达的共同调节。其中DNA甲基化可以通过调节相关基因与转录因子的结合和改变染色质的结构来调节基因的表达,进而参与脂肪沉积的重要生命过程。鉴于此,本试验以德州驴为研究对象,研究全基因组甲基化及相关基因启动子区甲基化水平和表达水平对德州驴肌内脂肪沉积的影响。方法:(1)本研究对1周岁和10周岁母驴背最长肌和股二头肌中水分、粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸进行测定,分析1周岁和10周岁驴背最长肌和股二头肌中营养成分。(2)以相同饲养条件下的120头2周岁公驴为研究对象,筛选出低IMF组和高IMF组,采用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)法构建高、低肌内脂肪基因组甲基化图谱,分析驴背最长肌DNA甲基化对肌内脂肪含量的影响,揭示驴背最长肌DNA甲基化对肌内脂肪相关肉品质性状的调控机制。(3)本试验通过荧光定量PCR和BSP甲基化检测法检测了PPARγ和LPL基因在2周岁公驴背最长肌与股二头肌不同IMF组中mRNA的表达量及启动子区CpG岛的甲基化水平,研究PPARγ和LPL基因mRNA的表达量与启动子区CpG岛甲基化图谱对肌内脂肪沉积性状的影响。(4)通过荧光定量PCR探究驴各内脏器官中肌内脂肪沉积相关基因的表达差异,本试验对比分析了2周岁公、母驴肌内脂肪相关的PPARγ、LPL、H-FABP、FASN、HSL、PLIN1基因在驴各内脏组织中的表达分布。结果:(1)随年龄差距增加,驴背最长肌和股二头肌中的水分降低,蛋白质含量变化则相反,粗脂肪含量增加,饱和脂肪酸的含量显著增加,其中硬脂酸的含量显著减少(P0.01)。(2)低IMF组与高IMF组只有在外显子(Exon)和启动子(Promoter)基因功能元件区域存在明显的甲基化差异,其他功能元件甲基化差异不明显(P0.01)。GO功能富集和KEGG通路富集分析表明,对高、低IMF组中基因功能元件中显著DMR相关的大多数基因与细胞发育、蛋白质结合、信号调节和一些脂肪通路相关。(3)驴背最长肌IMF含量升高,PPARγ基因mRNA表达下降,而LPL基因mRNA表达上升;PPARγ基因启动子区有10个CpG位点,其中6、7位点(-143bp、-145bp序列处)的甲基化程度较高,在背最长肌H组中,第6、7位点甲基化程度分别为100%和90%,其显著高于其他位点;LPL基因启动子区有12个CpG位点,其中1、2、9和10位点(-43bp、-59bp、-139bp、-152bp、-165bp、-181bp序列处)的甲基化程度较高;并且PPARγ和LPL基因启动子区CpG岛甲基化程度与基因mRNA的表达量相反。(4)脂肪沉积相关基因在驴内脏表达的研究发现,PPARγ主要在脾和肺中表达较高;HSL和LPL主要在心脏和肾脏中表达较高;H-FABP基因在心脏中表达较高;PLIN1基因在肝脏中表达较高;而FASN基因在心脏和脾脏中表达最低。结论:(1)在1周岁驴和10周岁驴营养成分相关指标发现,1周岁驴肉更适合人们对健康饮食的需求,但风味上10周岁驴肉更加鲜美。(2)在Exon和Promoter功能元件中甲基化差异明显,说明Exon和Promoter在驴肌内脂肪沉积过程中起重要作用。根据DMR的GO富集和KEGG富集结果分析,筛选了与脂肪沉积相关的PPARγ和LPL基因。(3)启动子区CpG岛甲基化水平高影响基因的表达,从而控制肌内脂肪的沉积量;我们还发现有些CpG位点呈高甲基化状态,可能是影响相关转录因子结合的关键位点。(4)肌内脂肪沉积相关基因在驴内脏表达存在显著差异,这些结果对研究肌内脂肪沉积的调控机制和选育提供理论依据。