犏牛精子发生阻滞相关microRNA鉴定与功能分析

作     者：徐传飞 

作者单位：西南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡欣

授予年度：2019年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：犏牛 雄性不育 miRNA STA-PUT 

摘      要：犏牛是雄性普通牛和雌性牦牛的种间F1代杂种,生产性能显著优于亲本,对青藏高原恶劣气候环境也具有杰出的适应能力,但雄性犏牛因精子发生阻滞不育极大的限制了其在牦牛杂交育种中的有效利用。miRNA作为一类非编码小RNA在转录后水平通过影响靶mRNA的稳定性或者抑制蛋白翻译过程从而调控基因的表达水平。为了解miRNA在犏牛精子发生阻滞中可能的调控作用,本研究通过illumina深度测序筛选鉴定牦牛及犏牛睾丸组织间差异表达miRNA;并初步分析了bta-miR-34c调控牦牛精原细胞分化的分子机制。结果如下:(1)通过牦牛与犏牛睾丸组织TUNEL-POD染色分析发现,犏牛睾丸组织生精小管内只有单层附着在生精小管基底膜的精原细胞以及少量精母细胞,无圆形或延伸的精子细胞,并且精原细胞最早开始发生凋亡,至精母细胞时期加重,从而导致后续精子发生中断以致无精子生成;(2)通过牦牛与犏牛睾丸组织转录组miRNA高通量测序以及生物信息学分析发现,61个miRNA在犏牛与牦牛睾丸组织之间差异表达显著,其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378和miR-184参与SSCs自我更新以及分化过程;miR-34c和miR-449a参与精子发生减数分离起始过程;(3)通过STA-PUT自然沉降法分离得到纯度较高的牦牛精原细胞和精母细胞;RT-PCR表型鉴定发现牦牛精原细胞呈CD9以及UCHL1阳性,精母细胞呈Tesmin以及SYCP3阳性;(4)通过分别转染牦牛精原细胞bta-miR-34c mimic以及inhibitor后发现,bta-miR-34c可能通过抑制CD4以及CDC25A的活性降低E2F转录因子的表达,从而促进精原细胞由有丝分裂向减数分裂转变的分化过程;同时还可能通过抑制HDAC1以及SIRT1的表达以激活p53通路诱导生殖细胞凋亡,以维持生精小管内生精细胞数目稳态。