犏牛精子发生阻滞相关lncRNA的鉴定与功能分析

作     者：伍仕鑫 

作者单位：西南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡欣

授予年度：2019年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：犏牛 生精阻滞 转录组测序 LncRNA LncRNANONBT-258 

摘      要：犏牛的雄性不育由精子发生阻滞引起,由此阻碍了牦牛育种中对杂交种犏牛优良基因的有效固定。多年来针对犏牛生精阻滞的产生机理进行了诸如组织形态学、细胞遗传学、内分泌学和分子生物学等多方面的探究,但是针对犏牛及其亲本牦牛之间睾丸长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的比较研究还未见报道。随着lncRNA在哺乳动物包括精子发生的众多生命活动过程中通过时空动态表达所发挥的重要生物学功能被一一挖掘,对犏牛和牦牛睾丸组织进行初步的lncRNA鉴定及功能初探则可能为犏牛雄性不育的分子机制探究带来新的见解。本研究利用二代高通量测序仪Hiseq 2500对源自同一生长条件下的12月±1月龄牦牛和犏牛的睾丸组织进行转录组测序和生物信息学分析;随后对lncRNA进行克隆和表达分析;最后采用STA-PUT法对牦牛和犏牛进行生精细胞的分离,并用siRNA转染牦牛生精细胞后对lncRNA进行功能初探。主要研究结果如下:1.转录组测序筛选到604个差异表达的lncRNAs(|Fold Change|≥2,P0.05),其中大部分(469个)在犏牛睾丸中低表达,且差异表达倍数极大和显著性极高的大部分lncRNAs也下调表达。这些lncRNAs转录本的平均长度和表达水平均显著不及mRNAs。2.差异表达lncRNAs靶基因的富集分析分别鉴定得到83个和32个显著富集的GO条目(P0.01)和KEGG通路(P0.05),这些靶基因参与犏牛生精过程中细胞分裂的起始,细胞周期负性调控和相变调控,细胞周期进程的检控,DNA复制的损伤检测及修复,同源重组和细胞的内吞、程序性死亡、生长、分化和凋亡,以及细胞物质代谢等重要的信号通路和生物学过程。3.差异表达lncRNAs和靶基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的定量表达分析,以及生精细胞标记基因和细胞周期相关基因在牦牛和犏牛生精细胞中的qRT-PCR分析均表明这些分子在犏牛中的表达与测序数据具有一致性,证实了转录组测序数据的可靠性。***在牦牛和犏牛个体中较高的同源性(98.29%)表明其在同属异种下具有较高的保守性,并可能在犏牛睾丸组织中发挥重要的功能作用。生信分析进一步预测出lncRNA的低编码能力和其与靶基因BRCA1强的互作能力。5.使用STA-PUT装置可以从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得生精细胞(包括精原细胞和精母细胞)。特异siRNA转染牦牛的生精细胞后未能成功降低lncRNA的表达水平,需对细胞转染条件进行优化。本实验表明,犏牛和牦牛睾丸组织之间存在大量差异表达的lncRNAs。这些lncRNAs的靶基因在与细胞周期进程、DNA复制、同源重组、细胞异常增殖的矫正、细胞粘附、迁移、免疫、代谢、程序性死亡和凋亡等相关的重要的生物学过程和信号通路上的富集程度存在显著的差异性,表明lncRNA可能通过调控靶基因的表达后参与生精细胞的生长、增殖和分化过程,进而影响犏牛的精子发生过程。