利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

作     者：孙慧宇 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹德堂

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 

主      题：粳稻 香味 Badh2 CRISPR/Cas9 

摘      要：水稻(Oryza sativa L.)是全世界最主要的粮食作物之一,全球大约一半的人口将大米作为主食,伴随着人们生活水平的不断提高,香稻育种已成为水稻育种行业的研究热点。水稻香味性状由第8号染色体上的隐性负调控基因Badh2控制,其功能丧失型突变体会使稻米产生香味。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以定向修饰和改造基因,且周期短、效率高,可以有效地弥补传统育种的不足,目前已经成为了水稻育种的新型手段。本研究以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因的第2和第3外显子进行定点编辑,借助成熟的粳稻遗传转化体系和转基因检测手段,获得了有不同程度香味、无T-DNA元件且主要农艺性状无显著变化的纯合突变材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了理论和材料基础。具体研究内容和结果如下:(1)构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体pYLCRISPR/Cas9-B1-gRNA(B1载体)和pYLCRISPR/Cas9-B2-gRNA(B2载体),B1载体的2个靶点分别位于第2和第3外显子,B2载体的2个靶点均位于第2外显子,通过农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,各获得18株和19株再生植株,经过转基因阳性检测,T代分别获得了15株和17株阳性转基因植株。(2)在分蘖盛期,用CTAB法提取T代植株全基因组DNA,并对靶点附近进行PCR测序分析。结果表明,阳性植株的突变类型主要是纯合突变和双等位突变,转B1载体纯合植株有5株,纯合率为33.33%,基因型多为1-2 bp的小片段插入和缺失;转B2载体的纯合植株有9株,纯合率为52.94%,基因型出现了67 bp和76 bp的大片段碱基缺失,最终2个载体在T代共获得8种基因型不同的纯合突变株系。对纯合突变株系和野生型的氨基酸序列进行比对分析,发现所有纯合突变株系均发生移码突变,最终获得了缺失大量氨基酸的截短蛋白质。(3)T代,每个纯合突变株系各选取30株单株提取叶片DNA,用Cas9-F/R引物进行PCR检测,转B1载体的3个株系共筛选出26株无T-DNA元件的纯合植株,转B2载体的5个株系共筛选出39株无T-DNA元件的纯合植株。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系中无T-DNA元件的水稻籽粒进行香味检测,结果表明8个株系均表现出不同程度的香味,B1载体编辑的3个株系香味总体上更为浓郁。(4)进一步对8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现除株高外,突变株系的穗数、每穗粒数、结实率及千粒重与野生型相比均无显著差异,Badh2纯合突变体的主要农艺性状并未因Badh2基因的编辑而受到影响。