罗伊氏乳杆菌J1益生特性初步评价及基因组学研究

作     者：张紫薇 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜毓君

授予年度：2019年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：乳酸菌 罗伊氏乳杆菌 胃肠道耐受性 免疫相关基因 全基因组测序 

摘      要：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是一种性能良好的乳酸菌,广泛应用于功能性食品的开发中。该菌株具有多种益生功能,其中罗伊氏乳杆菌对机体的免疫调节功能受到了广泛关注。在菌株特性的评价过程中,传统的评价方法多以生化试验为基础,但随着全基因组测序技术的成熟,研究者可从生物信息角度在微生物基因结构的基础上,探索微生物的生物学功能,大大推进了乳酸菌研究的发展。由于乳酸菌具有菌株特异性,因此,本研究将体外试验与基因组学相结合对罗伊氏乳杆菌J1的免疫功能和分子生物学信息进行研究,为揭示罗伊氏乳杆菌益生机理以及遗传特性奠定基础。本研究以罗伊氏乳杆菌J1(*** J1)为研究对象,该菌株分离自传统发酵乳制品,对其黏附能力、胃肠道耐受性、抑菌能力以及免疫调节功能等益生特性进行初步评价,进一步利用全基因组测序技术对其进行基因组组分分析和比较基因组研究,挖掘该菌株的遗传基础。通过上述研究,得到以下研究结果:(1)罗伊氏乳杆菌J1具有较强的黏附能力。其黏附数为867±88.0 CFU/100Caco-2 Cells,黏附率可达87.93%,与试验中的对照菌株相比,该菌株具备较好的黏附能力。(2)罗伊氏乳杆菌J1具有定植于胃肠道中的潜力。通过人工模拟胃肠道环境评价菌株对胃肠道环境的耐受性,罗伊氏乳杆菌J1分别在pH为2.0和3.0条件下处理3 h后,该菌株存活率分别为86.77%和97.12%;在0.3%、0.5%和1.0%(v/v)浓度的胆盐配制的MRS培养基中处理4 h后,其存活率分别为105.00%、82.60%和82.18%;在模拟人工胃液中经过3 h处理后,将菌株转移至人工肠液继续培养8 h,存活率达82.71%;该菌株在7 g/100mL的盐溶液中处理24 h后,其存活率为80.36%,该菌株具有良好的胃肠道环境耐受能力。(3)罗伊氏乳杆菌J1具有一定的抑菌能力。采用杯碟法评价菌株的抑菌能力,罗伊氏乳杆菌J1的发酵上清液可有效抑制革兰氏阳性菌蜡样芽胞杆菌和单增李斯特氏菌的生长,对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌无抑制作用。菌株甘油发酵液作用于指示菌后无抑菌圈生成,判断该菌株不具备将甘油转化为罗伊氏菌素的能力。(4)罗伊氏乳杆菌J1具有免疫调节能力。提取罗伊氏乳杆菌J1作用后的Caco-2细胞的RNA,通过real-time RT-PCR检测Caco-2细胞中免疫相关细胞因子的表达,发现该菌株能够显著刺激细胞中IL-1α、IL-1β和CCL20的mRNA表达,抑制IL-6和IL-8基因的mRNA表达,并且mRNA的表达量随时间不同而变化。(5)罗伊氏乳杆菌J1基因组基本特征分析。罗伊氏乳杆菌J1的基因组中存在1个染色体和5个质粒,长度分别为2045363 bp、56896 bp、18542 bp、18059 bp、10362 bp和8492 bp,GC含量为39.3%(染色体)。共有2189个编码基因,18个基因岛和88个非编码RNA,COG数据库中注释的蛋白编码基因有1928个。在罗伊氏乳杆菌J1基因组中发现与荚膜多糖和脂磷壁酸合成相关的基因,进一步验证了菌株的免疫功能。(6)通过比较基因组,对罗伊氏乳杆菌J1的亲缘关系进行分析,该菌株属于罗伊氏乳杆菌,与其它6株罗伊氏乳杆菌相对,平均核苷酸一致性均在95%以上。