TLR4/NF-κB p65信号通路介导雷公藤甲素内皮保护作用的实验研究

作     者：宗佳琪 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王海华

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：雷公藤甲素 细菌脂多糖 人脐静脉内皮细胞 共培养 胸主动脉环 TLR4/NF-κB p65信号通路 

摘      要：目的:通过细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,10mg/kg,ip)复制内毒血症大鼠模型,探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对其心血管功能的作用,同时结合LPS共培养(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)细胞,观察TP对LPS刺激HUVEC细胞炎性损伤的影响,旨在探讨TP防治内毒血症的新靶点及依据。方法:1.动物实验取雄性SD大鼠60只,腹腔注射10mg/kg的LPS(L82749,Lipopolysaccharide,026:B6)来复制内毒血症大鼠模型。TP干预组在大鼠腹腔注射LPS前15 min进行预处理。将大鼠分为正常组(NC组)、内毒血症模型组(LPS组)、TP低浓度干预组(LPS+TP-L组,25μg/kg)、TP中浓度干预组(LPS+TP-M组,50μg/kg)、TP高浓度干预组(LPS+TP-H组,100μg/kg)和多粘菌素B组(LPS+PMX-B组,0.2mg/kg)。各组大鼠行颈总动脉插管,分别测量平均动脉压(mean arterial blood pressure,MABP)和血流动力学指标:心率(heart rate,HR)、左室舒张压(left ventricular diastolic pressure,LVDP)、左心室内压最大上升/下降速率(maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure,±dp/dt)。ELISA法检测大鼠血清中BNP、CK-MB和cTn-Ⅰ的含量;血浆中TNF-α和IL-6的含量。Western Blot法检测大鼠心肌组织中p65蛋白的含量,胸主动脉血管组织中iNOS、eNOS、TLR4和p65蛋白的含量。2.血管环张力实验:实验分组同在体实验部分,血流动力学指标检测完成后,取各组大鼠胸主动脉血管环,通过PL3508B5/C-V体外组织灌流装置和Power Lab系统记录血管环张力变化。***细胞实验:正常培养的HUVEC细胞随机分为正常对照组(NC组)、LPS组和TP+LPS组。NC组:细胞正常培养,不做任何其他处理;LPS组:细胞在正常培养的基础上,用1000ng/ml的LPS进行刺激12h;TP+LPS组:通过CCK-8法筛选出TP(浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8、10、20、30、50、100、200、300、400、500、800、1000μg/ml)对HUVEC细胞的安全范围,用安全浓度的TP预处理HUVEC细胞2h,再用1000ng/ml的LPS共培养HUVEC细胞,分别收集作用时间为0、1、2、3、4、5、6、8、12、16、18、20、24、30、36h、48h细胞上清液,NC组和LPS组只收集作用时间12h时的细胞上清液,通过ELISA法检测各组细胞上清液中的TNF-α和IL-6含量的变化。细胞分组同上,TP+LPS组:分别提取作用时间为0、6、12、18、24h细胞蛋白,NC组和LPS组只提取作用时间12h的细胞蛋白,通过Western Blot法检测各组细胞中eNOS、TLR4、p65含量的变化。结果:1.动物实验(1)各组大鼠血流动力学的变化与NC组比较,LPS组大鼠MABP和血流动力学指标HR、LVDP、±dp/dt均显著下降(P0.05)。与LPS组相比,LPS+TP-M组、LPS+TP-H组与LPS+PMX-B组大鼠MABP明显改善(P0.05)。与LPS组相比,LPS+TP-L组、LPS+TP-M组、LPS+TP-H组、LPS+PMX-B组BNP的含量显著降低(P0.05);LPS+TP-L组、LPS+TP-M组、LPS+TP-H组、LPS+PMX-B组血清中的CK-MB和cTn-Ⅰ的含量显著降低(P0.05);LPS+TP-H组、