波形蛋白介导2型登革病毒感染的作用机制研究

作     者：李旭娟 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵卫;柯昌文

授予年度：2019年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：登革病毒 波形蛋白 中枢神经系统 HBMEC 

摘      要：一、背景:登革病毒(dengue virus,DENV)是黄病毒科黄病毒属的一种主要经蚊虫传播的单股正链RNA病毒,根据抗原表位的不同分为DENV1-4四种血清型,四种血清型都可以引起登革热(dengue fever,DF)和重症登革热(severe dengue,SD)。研究显示,大约10%的登革热患者在感染期间或之后出现神经系统并发症,其致病机制可能为病毒通过直接侵袭感染神经组织诱导神经功能障碍,这些神经系统并发症包括脑炎、脑膜炎、脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM),格林-巴利综合征和视神经炎等。血脑屏障(BBB)的主要组成细胞人脑微血管内皮细胞(HBMEC)可以感染登革病毒,因此HBMEC可能成为登革病毒侵入神经组织的途径之一。波形蛋白是中间丝蛋白Ⅲ的结构蛋白之一,不仅参与多种细胞进程,还与病原体的入侵和感染有关,已有研究发现登革病毒的入侵可以引起波形蛋白的磷酸化反应并且引起波形蛋白重排,但波形蛋白在登革病毒感染细胞的过程中所起作用未见报道。本研究拟用体外实验研究波形蛋白在DENV-2感染HBMEC细胞过程中的磷酸化、溶解度、表达水平的动态变化,并利用体外实验和动物模型探索波形蛋白在DENV-2感染入侵宿主细胞过程中的作用。二、方法:1.富集病毒并验证DENV-2感染HBMEC致细胞病变效应将感染登革病毒的鼠脑组织研磨过滤后收集病毒液,在C6/36细胞上连续传代,用TCID50法与噬斑形成实验检测活病毒滴度。将DENV-2感染HBMEC、HBMEC(con)、HBMEC(vim-ko)细胞(MOI=5),连续5 日观察细胞CPE。2.波形蛋白在DENV-2感染HBMEC细胞过程中的作用机制研究免疫荧光法观察DENV-2感染HBMEC细胞(MOI=5)0、1、2、6、12、24h后波形蛋白的重排。DENV-2感染HBMEC细胞(MOI=5)0、1、2、6、12、24、36、48h后用western blot法检测波形蛋白的表达水平、磷酸化水平和溶解度变化。DENV-2感染HBMEC(con)、HBMEC(vim-ko)细胞(MOI=5)后,分别用实时无标记细胞功能分析仪实时监测两组细胞状态,用实时荧光定量PCR法(QPCR)检测感染后2h细胞内病毒载量。3.DENV-2感染乳鼠模型上探索波形蛋白在病毒感染中的作用SV129与SV129(vim-ko)一日龄乳鼠颅内注射DENV-2,感染后1-5日记录观察两组乳鼠体重、体征和症状,用QPCR法检测乳鼠第3、4、5日血清与脑组织中的病毒载量,摘取感染后第5日乳鼠脑组织制作病理切片。三、结果:1.DENV-2NGC株连续扩增后检测的活病毒滴度为2.6×106PFU/mL。2.波形蛋白在DENV-2感染后发生重排,并且其表达水平、磷酸化水平和溶解度随着感染时间的变化产生显著的动态变化。与对照组HBMEC(con)相比,DENV-2入侵HBMEC(vim-ko)时细胞生物学状态变化更明显,细胞内的病毒载量更多(P0.05)。3.与SV129相比,SV129(vim-ko)一日龄乳鼠颅内注射DENV-2后症状更为严重,感染后第4日第5日颅内与血清中病毒载量显著更高(P0.05)。四、结论:本研究证明HBMEC、HBMEC(con)、HBMEC(vim-ko)细胞均对DENV-2易感。HBMEC细胞感染DENV-2不同时间后其波形蛋白发生重排,感染过程调控波形蛋白的表达量、磷酸化水平和溶解度随之产生动态变化。波形蛋白可能抑制DENV-2在宿主细胞中的入侵,在动物水平上可能抑制病毒的感染、复制与释放。