炎陵银边茶斑锦变异的分子机理研究

作     者：卢翠 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈程文

授予年度：2018年

学科分类：09[农学] 090203[农学-茶学] 0902[农学-园艺学] 

主      题：茶树 斑锦变异 转录组测序 WGS-seq变异检测 Small RNA测序 

摘      要：茶树(Camellia sinensis(L.)***.)作为我国重要经济作物,也是一种叶用植物,茶树叶片的叶色变化对于茶树生长发育及抗逆性、茶叶加工工艺及滋味等均有重要影响。至今发现茶树叶片主要有绿色、白色、黄色、紫色、斑锦等叶色表型,茶树叶色突变体的大部分品种是由自然变异单株通过人工培育而成,国内外对于茶树叶色斑锦变异的研究几乎为空白。本研究材料炎陵银边茶为叶色斑锦突变体,叶色表现为白绿嵌合的斑锦表型。采用RGB颜色空间对实验材料的叶色进行量化比对;利用石蜡切片技术观察不同叶色组织的结构;运用扫描与透射电镜技术观察不同叶色组织的叶表皮、叶绿体结构。研究发现炎陵银边茶幼嫩叶片和成熟叶片的正常组织与白化组织的光合色素、儿茶素、没食子酸含量存在显著差异;炎陵银边茶白化组织与正常组织叶片、表皮及叶绿体的结构显著不同。通过对炎陵银边茶不同组织WGS-seq变异检测分析得到了不同组织间大量的SNP以及InDel位点。筛选测序质量较高的10个SNP位点进行克隆验证,测序结果显示两个样本所测位点基因型是相同的,不支持WGS-seq的结果,推测两种组织的基因型相同,并未发生突变,WGS-seq变异检测分析得到大量SNP与InDel位点的原因还需后续实验进一步分析。通过对炎陵银边茶不同组织的转录组测序,筛选出351个差异表达的转录因子,属于57个转录因子家族。通过KEGG富集分析发现白化组织样品的光合作用、光合作用-天线蛋白、乙醛酸和二羧酸代谢、类胡萝卜素生物合成、甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢、光合生物体的碳固定等生化代谢途径和信号转导途径显著下调,而类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、非同源性末端接合、谷胱甘肽代谢等生化代谢途径和信号转导途径显著上调(p﹤0.05)。对炎陵银边茶不同组织进行Small RNA测序,能比对到参考基因组的比值在82%以上。鉴定到的已知miRNA成熟体(mature)272个、前体(hairpin)621个;预测到的novel miRNA成熟体(mature)135个、前体(hairpin)149个。通过Small RNA与转录组测序数据关联分析共得到60个差异表达的miRNA及其调控下差异表达的32个mRNA。这些mRNA中有20个属于HB、GRF、MYB、CCAAT、SBP、GRAS、AP2-EREBP、NAC和RWP-RK这9个家族。其中miRNA基因ath-miR156h上调表达并调控RSH1基因(CSA005911)下调表达,RSH1基因编码叶绿体中(p)ppGpp合成酶,能通过与RNA聚合酶直接相互作用来控制大量基因的转录从而响应外界环境的胁迫;smo-miR396表达上调而靶基因CHUP1基因(CSA015736)下调表达,CHUP1基因参与叶绿体移动;miR408下调表达,这个miRNA家族对植物中铜稳态机制起调节作用,与植物光合作用相关。通过荧光定量PCR技术验证发现CHUP1基因(CSA015736)、RSH1基因(CSA005911)、osa-miR408-3p与其他4个基因的表达趋势与测序数据相同;smo-miR396与ath-miR156h基因的表达趋势与测序数据相反。推测是由于CHUP1基因(CSA015736)、RSH1基因(CSA005911)与miR408基因的差异表达导致了炎陵银边茶的斑锦表型。