小麦抗条锈病基因Yr10功能结构域的初步探究

作     者：罗毅 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：慕小倩;王晓静

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：小麦条锈病 抗病基因 Yr10 结构域 细胞坏死 

摘      要：小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.***.tritici)引起的重要的小麦病害,在全球小麦产区普遍流行,给小麦的生产带来重大的损失。小麦条锈菌是一种活体寄生真菌,也是一种转主寄生菌,在小麦上进行无性繁殖,产生夏孢子、冬孢子和担孢子,在转主寄主小檗上进行有性生殖,产生性孢子和锈孢子。小麦条锈菌还有众多的具有不同致病力的生理小种,条锈菌生理小种很容易发生毒性变异,这导致抗病小麦品种抗性“丧失现象时有发生。因此,小麦抗锈育种是一项长期且艰巨的工作,含有抗条锈病基因的抗源材料的发掘,抗条锈病基因的染色体定位以及克隆是小麦抗锈育种的关键。目前,大约有80个抗条锈病基因位点被正式命名,但只有6个抗条锈病被克隆出来。抗条锈病基因Yr10来源于普通小麦“Moro,是一个全生育期小种特异性抗病基因,在我国大部分地区,Yr10对大多数的当地流行的条锈菌生理小种还具有抗性。因此,Yr10抗病基因在抗病育种中还具有重要利用价值。Yr10编码一个典型的CC-NB-LRR抗病蛋白,但对其功能的研究还未见报道。因此,开展对其功能的研究很有必要,通过对其功能的研究可以明确其发挥抗病的分子机制,为Yr10在今后抗病育种中的合理利用提供理论依据。本研究在Yr10的前期研究基础上展开,我们通过分析发现,目前克隆的Yr10抗病基因并不完整,并最终克隆获得Yr10基因全长,在此基础上对Yr10的功能结构域进行了初步研究。主要研究结果如下:1.通过分析发现目前克隆的Yr10序列(AF149112)并不完整,并最终克隆到一条包含四个外显子和三个内含子的新的Yr10基因序列。新的Yr10编码区全长为2541bp,编码846 aa,命名为Yr10-1;另外还获得了一条缺失了8 bp碱基的序列,编码区全长2604 bp,编码867 aa,命名为Yr10-2,二者编码蛋白Yr10-1和Yr10-2仅在C-端末尾部分存在差异。Yr10-1是一个典型的CC-NBS-LRR类抗病蛋白,分子量大小约95.8 kDa,理论等电点为6.82,是一个亲水性蛋白。Yr10-1的生物信息学预测显示其无跨膜结构和信号肽,定位于细胞质,参与抗病反应和响应水杨酸信号,具有结合ADP/ATP的功能。系统发育树分析显示Yr10-1与乌拉尔图小麦(Triticum urartu)中的抗病蛋白的TuRPM1亲缘关系相近。2.通过农杆菌介导的瞬时表达体系在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达Yr10-1与GFP的融合蛋白,发现其定位于细胞质,并且能诱导烟草产生细胞坏死(cell death),而改变Yr10-1的亚细胞定位使其定位于细胞核时不能诱导烟草产生细胞坏死。同样的,通过农杆菌介导的瞬时表达体系在小麦AvS中表达定位于细胞质的Yr10-1后也能诱导产生细胞坏死,使其对条锈菌CYR32的抗性增强,孢子量减少。上述结果表明,Yr10-1需要定位于细胞质才能诱导产生细胞坏死和发挥抗病作用。3.通过对Yr10-1功能结构域的研究,我们证明了Yr10-1中诱导产生细胞坏死的关键结构域是N-端的CC结构域,核心区域位于1-116之间。CC结构域在烟草中表达后能诱导产生HO,其保守的“EDVID基序在CC结构域诱导产生细胞坏死中具有重要的作用。并且证明了CC结构域只有定位于细胞质时才能诱导产生细胞坏死,与Yr10-1全长诱导产生细胞坏死的定位相同。通过免疫共沉淀和双分子荧光互补技术证明了CC结构域自身之间可以发生相互作用。