盐酸克伦特罗的免疫层析检测方法研究

作     者：赵兵欣 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张道宏

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 07[理学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：盐酸克伦特罗 单克隆抗体 金纳米颗粒 普鲁士蓝纳米颗粒 试纸条 

摘      要：盐酸克伦特罗(CL),是一种β-肾上腺素受体激动剂。由于其可以改变动物体内的代谢途径,加快脂肪的分解和转化,加速蛋白质合成,20世纪80年代开始盐酸克伦特罗被用作饲料添加剂以提高动物的瘦肉率。然而,盐酸克伦特罗性质稳定、半衰期长,很容易在动物体内造成积累,人一旦食用残留过多CL的动物制品,就会造成食物中毒,严重者甚至导致死亡,世界各国已纷纷禁止将CL用作兽用饲料添加剂。尽管如此,目前仍有许多不法分子违规使用,对食品安全造成了重大隐患。因此,为确保食品安全,维护消费者的健康,急需建立快速、可靠的CL检测方法。本研究以CL为检测目标物,制备了抗盐酸克伦特罗单克隆抗体,基于该抗体建立了两种免疫层析检测方法,实现了猪肉、培根、牛奶等食品中CL的快速检测。本论文的研究成果如下:(1)抗CL单克隆抗体的制备及性能评价:采用小鼠体内诱生法制备含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体(mAb)的腹水,纯化后得到单克隆抗体。之后对抗体进行鉴定,结果表明抗体的效价为1:32000,抗体对CL的50%抑制浓度(IC)为0.69 ng mL,该抗体为后续免疫层析试纸条的制备提供了核心材料。(2)基于金纳米颗粒的盐酸克伦特罗免疫层析试纸条的研制及性能鉴定:将制备的金纳米颗粒(15 nm)作为信号标签,标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体,从而制备GNP-mAb探针。通过一系列的优化,确定了探针中抗体的最佳标记量,NC膜上抗原的最佳包被浓度,样品垫的最佳封闭液成分和探针的最佳使用量。在最佳状态下,该试纸条对盐酸克伦特罗标准溶液的可视化检出限(VDL)为5 ng mL,特异性测定表明试纸条与其它五种盐酸克伦特罗结构类似物无交叉反应,特异性强。将该试纸条用于实际样品(猪肉、培根和牛奶)中盐酸克伦特罗的残留监测,结果发现,其可视化检出限分别为10 ng g、10 ng g和10 ng mL。(3)基于普鲁士蓝纳米颗粒的盐酸克伦特罗免疫层析试纸条的研制及性能鉴定:本研究通过经典水热法合成普鲁士蓝纳米颗粒。通过静电吸附的方式将普鲁士蓝纳米颗粒与抗盐酸克伦特罗单克隆抗体结合在一起,制备PBNP-mAb探针。由于普鲁士蓝纳米颗粒粒径较大,且颜色鲜亮,仅需要极少量的PBNP-mAb探针就可以使检测线清晰可见,大大节省了抗体的使用量;而抗体的用量减少,又可引发游离的CL与固定化抗原之间对抗体更为激烈的竞争,从而提高了免疫层析分析的灵敏度。对试验条件进行一系列优化,在最优条件下,基于普鲁士蓝纳米颗粒的试纸条对盐酸克伦特罗标准溶液的可视化检出限为1.0 ng mL,与传统胶体金试纸条相比,灵敏度提高了5倍。该试纸条与沙丁胺醇和莱克多巴胺无交叉反应,特异性强。最后,将该方法在猪肉、猪肾、培根和牛奶样品盐酸克伦特罗的残留检测中成功进行了应用,结果发现,其可视化检出限分别为3 ng g、5 ng g、5 ng g和5 ng mL。