基于转录组水平的苹果抗白粉病基因筛选与感病叶片生理指标分析

作     者：田小敏 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高华;王西平

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：苹果白粉病 转录组测序 植物激素 转录因子 植物病原菌互作 

摘      要：苹果(Malus domestica Barkh)在世界范围内广泛种植,近年来苹果产业的发展成为我国农民脱贫致富和乡村振兴的一大助力,在我国农业经济中占据着重要地位。然而,由活体专性寄生的白叉丝单囊壳真菌(Podosphaera leucotricha)引发的白粉病是苹果生产中最常见的病害之一,给苹果的生产带来巨大的经济损失。目前,苹果抗白粉病的分子机制还未完全明晰,苹果抗白粉病基因还需要继续挖掘鉴定。鉴于此,本研究以探索苹果响应白粉病的机理为目的,选取了本课题组新培育感病苹果品种‘瑞阳’为试验材料,通过二代测序技术,开展对白粉病不同侵染时期苹果叶片的转录组分析,系统性地研究不同侵染时期的差异表达基因(DEGs)及其相关代谢通路,并测定感病叶片的抗氧化酶活性变化以及脯氨酸、丙二醛、可溶性糖以及叶绿素含量的变化,通过台盼蓝、DAB、NBT染色对感病叶片进行组织形态观察,获得的主要研究结果如下:1、以感病苹果‘瑞阳’为试材,设置4个不同的苹果白粉菌接种时间,分别为0 h、12 h、24 h、48 h及对应时间的清水处理为对照,每个时间点样品混合池进行转录组测序。测序共得到高质量的214.16 Gb Clean Data,每份材料与参考苹果基因组的比对率均在80%左右。将表达倍数FC≥2且错配率FDR≤0.05的基因筛选出来,最终共获得1159个差异表达基因。对筛选到的所有差异表达基因进行GO功能注释,发现参与代谢过程、细胞过程、催化活性、生物调控和对刺激的响应的差异基因数量最多。2、对差异表达基因参与的代谢通路进行了富集性分析,结果显示,苹果在受到白粉病侵染过程中差异表达基因富集程度最高的代谢通路是植物激素信号转导途径,其次是植物病原菌互作通路和苯丙氨酸代谢通路。通过对5个植物激素相关的信号通路及植物真菌互作通路上的差异基因表达模式分析,筛选出这些通路上编码关键元件的差异表达基因作为苹果抗白粉病的候选基因。对所有差异表达基因进行分析,共获得136个转录因子和46个转录调节子,含有最多差异表达基因的转录因子家族依次为AP2/ERF、NAC、MYB和WRKY。通过qPT–PCR对油菜素内酯激素通路上的4个差异表达基因和植物真菌互作通路上的8个差异表达基因的表达水平进行定量验证,结果显示,荧光定量中基因的表达水平变化趋势和转录组测序结果中差异基因的表达水平变化趋势基本一致。3、采集被白粉菌侵染0、1、3、5、7、10 d的苹果叶片鲜样,进行组织化学观察,台盼蓝、DAB、NBT染色试验发现,被侵染的植株中死细胞、过氧化氢和活性氧不断积累;对比各项指标对病原菌的响应情况,对苹果叶片中的脯氨酸、叶绿素、可溶性糖和丙二醛含量,以及抗氧化酶(POD、SOD、CAT)和β-1,3-葡聚糖酶活性的进行了测定。结果发现,被侵染的植株中脯氨酸和丙二醛的含量增加,相关酶活性增强,叶绿素含量下降,可溶性糖含量稳定上升至最高水平后急剧下降。这体现了苹果叶片对活体寄生菌显著增强的抗性。通过对相关基因进行表达分析,得出基因表达情况与相对应的生理指标变化情况相符。4、结合前人研究基础和本研究,绘制了一个苹果叶片在防御白粉病侵染时可能存在的分子调控网络图。这个过程可以分为四个阶段:信号转导、转录调控、下游功能蛋白质的合成和相关代谢物的产生,植物的某些生理指标也发生了相应的改变,苹果叶片对白粉病的抗性增强。