鞘氨醇激酶1和1-磷酸鞘氨醇受体2在颞叶癫痫中的作用机制研究

作     者：董媛媛 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孔庆霞

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：颞叶癫痫 鞘氨醇激酶1 1-磷酸鞘氨醇受体2 星形胶质细胞 神经元 

摘      要：研究目的癫痫是常见的神经系统疾病,特征是反复不可预测的癫痫发作,影响着全世界5000万以上的人,大约有30%的癫痫患者发展为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE)。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是成人中最常见的IE类型之一,最重要的病理特征是海马硬化(hippocampal sclerosis,HS),包括选择性神经元丢失和胶质细胞增生。海马硬化可能既是癫痫发作的原因又是癫痫发作的结果。癫痫长期反复发作导致癫痫患者进行性的脑组织损伤和认知功能障碍。目前,最常见的导致癫痫的原因有炎症、氧化应激、神经毒性、神经元死亡、胶质增生和血脑屏障功能障碍等。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)催化鞘氨醇磷酸化,由此形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)。S1P是一种重要的免疫调节因子,通过G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)家族(S1PR1-S1PR5)介导其生理作用。SphK1和1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)是SphK1/S1P信号通路中的重要信号分子。目前,SphK1/S1P信号通路在肿瘤中已有广泛的研究,尤其是SphK1在乳腺癌、结肠癌等病灶组织中过度表达,证明其参与了癌症的发生和发展。SphK1在癌症细胞中的表达水平与患者的预后密切相关,被作为癌症治疗的潜在药物靶点。SphK1/S1P信号通路存在调节淋巴细胞转运、胶质细胞的活化、血管收缩、内皮屏障功能和神经元死亡的途径,在缺血性脑卒中、阿尔茨海默病(AD)、多发性硬化(MS)等中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病中起着至关重要的作用。目前,SphK1和S1PR2在TLE中的研究相对较少,SphK1、S1PR2在TLE中的表达变化和具体作用机制仍需进一步研究。本研究运用锂-匹罗卡品(Li-PILO)诱导TLE大鼠模型和收集临床难治性TLE患者手术切除的颞叶皮质,研究SphK1和S1PR2在TLE大鼠海马组织和TLE患者手术切除颞叶皮质中的表达变化及在星形胶质细胞(astrocytes,AST)和神经元中的表达情况,探讨SphK1、S1PR2在TLE的发病中可能的作用机制。研究方法1.采用Li-PILO建立TLE大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为3个大组,6个亚组:急性期组(E6h、E1d、E3d)、潜伏期组(E7d)和慢性期组(E30d、E56d),并随机选择相应的正常大鼠为对照组。应用Western blot分别检测SphK1与S1PR2在急性期、潜伏期、慢性期TLE大鼠海马中的动态表达;免疫荧光染色检测SphK1与S1PR2在海马AST和神经元中的表达。2.将脑外伤颅内减压切除颞叶皮质的10例颅脑外伤患者纳入对照组,行颞叶皮质切除的16例难治性TLE患者纳入癫痫组。应用免疫组化检测SphK1、S1PR2在颞叶皮质中的表达变化;免疫荧光染色观察SphK1与S1PR2在颞叶皮质AST和神经元中的表达。研究结果1.TLE动物模型情况:成功建立48只TLE大鼠模型,造模成功率为80%。在急性期(E6h、E1d、E3d)观察到TLE大鼠癫痫发作、精神萎靡、进食减少,潜伏期(E7d)无癫痫发作,慢性期(E30d、E56d)观察到反复自发性癫痫发作,以Ⅳ级以上的发作为主。2.Western blot结果发现,与对照组相比,SphK1在大鼠SE后E3d、E7d、E30d、E56d海马中的表达明显增加(P0.05),而S1PR2在E3d、E7d、E30d、E56d大鼠海马中的表达明显减少(P0.05)。3.免疫荧光染色结果发现,TLE大鼠(E7d)海马区AST数目明显高于正常大鼠(P0.05);正常大鼠AST分叉少、纤细,TLE大鼠海马AST分叉多且粗大、呈放射状,AST呈活化状态;SphK1在正常大鼠和TLE大鼠(E7d)海马区AST的细胞核中表达;S1PR2在正常大鼠海马区AST的胞核和胞质中表达,在TLE大鼠(E7d)海马区AST的胞质中表达;免疫荧光染色没有检测到SphK1和S1PR2在海马神经元中的表达。4.免疫组化结果:与对照组比较,SphK1阳性细胞数在TLE患者颞叶皮质中明显增多(P0.05),而S1PR2阳性细胞数在TLE患者颞叶皮质中明显减少(P0.05)。5.免疫荧光染色发现,TLE患者颞叶皮质中的一部分AST呈活化状态;与对照组比较,TLE患者颞叶皮质中AST数目明显增多(P0.05);SphK1在正常和TLE患者颞叶皮质AST和神经元中均有表达;S1PR2在对照组和TLE患者颞叶皮质AST和神经元中表达。研究结论SphK1在TLE大鼠海马和难治性TLE患者颞叶皮质中的表达升高,S1PR2在TLE大鼠海马和难治性TLE患者颞叶皮质中的表达减少。SphK1和S1PR2在TLE大鼠海马AST中表达,SphK1和S1PR2在难治性TLE患者颞叶皮质AST和神经元中表达。SphK1和S1PR2的表达改变可能参与了颞叶癫痫的发病。本研究为后期研究SphK1和S1PR2在TLE中的作用机制提供了一定的实验依据。