循环肿瘤细胞检测在肝细胞肝癌中的应用

作     者：郝原 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙青

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：CTCs 免疫细胞化学双染 EPCAM和CD45 形态学 HCC 

摘      要：目的对比两种型号的CTC-BIOPSY(?)平台用于检测肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的效果;研究免疫细胞化学双染法对HCC的CTCs定性检测的意义,并对HCC的CTCs的免疫学、形态学特征进行分析;探讨EPCAM+CTCs与HCC患者性别、年龄、肝硬化、术前AFP、术前HBV、Edmondson-steiner病理分级、脉管癌栓、肿瘤最大径、病灶数量以及Ki-67增殖指数的相关性,各临床病理特征与临床预后之间的相关性;分析免疫细胞化学双染法检测EPCAM+ CTCs对病人预后的指导意义。方法选取山东省千佛山医院肝胆外科78例经组织病理学检查确诊的HCC患者作为研究对象,采集患者术前外周血液、术中肝静脉血液以及术后外周血液。本研究已通过山东省千佛山医院伦理委员会的审核批准,所有受试者入组前均已签署知情同意书。采用CTC-BIOPSY(?)(D100)和CTC-BIOPSY(?)(A10)平台分别对采集的血液进行CTCs检测,评估染色效果,比较两种型号机器针对HCC的CTCs的检测效果;运用CTC-BIOPSY(?)(A10)分选CTCs,采用免疫细胞化学染色法标记EPCAM和CD45,结合形态学特征鉴定HCC的CTCs细胞,分析患者术前、术后CTCs的数量变化以及HCC的CTCs的形态学特征;运用病案管理系统与病理工作站搜集患者的临床资料,如性别、年龄、脉管癌栓等,运用统计学方法分析EPCAM+CTCs与各种临床因素的相关性。结果1.两种检测平台比较:CTC-BIOPSY(?)(D100)检测HCC的检出率为术前8%(4/47)、术中12.7%(6/47),术前和术中肝静脉血堵管率均高达19.15%(9/47);显微镜下观察,滤膜上细胞重叠,较多胞膜破裂,不易观察,染色色度较深,肿瘤细胞不易观察。后期我们选择CTC-BIOPSY(?)(A10)检测HCC的CTCs,术前血CTCs检出率为54.34%(17/31)、术中血CTCs检出率为22.58%(7/31),术前和术中肝静脉血均未发生堵管现象。2.术前、术后CTCs数量的变化以及HCC的CTCs的形态学与免疫学特征:CTC-BIOPSY(?)(A10)系统下根据形态学指标CTCs检测发生率和平均CTCs计数均显示术后(9.23%,平均0.37个细胞)较术前(32.3%,平均2.43个细胞)降低,差异有显著统计学意义(P=0.0008。经免疫细胞化学双染,在HCC中的CTCs显示胞膜、胞浆棕黄色颗粒状(EPCAM阳性、CD45阴性),WBC呈胞膜酒红色(CD45阳性、EPCAM阴性)。免疫细胞化学双染法检测CTCs的阳性率为100%,与形态学阳性之间的符合率为术前100%(21/21)、术中100%(13/13)、术后100%(6/6)。***+ CTCs与HCC患者临床及病理特征的关系:EPCAM+ CTCs与患者年龄、有无脉管内癌栓具有相关性(P0.05);而与性别、肝硬化、术前AFP、术前HBV、Edmmondson-steiner病理分级、肿瘤最大径、病灶数量以及Ki-67增殖指数不具有相关性。4.临床及病理特征与患者预后的关系:单因素分析显示,肝硬化、癌栓、EPCAM+CTCs、Ki-67增殖指数具有统计学意义,是影响PFS的显著独立预后因素(P0.05);多因素分析发现EPCAM+ CTCs、肝硬化为影响PFS独立预后因素(P0.05)。***+CTCs与患者预后的关系:K-M曲线分析EPCAM+ CTCs与HCC患者生存预后的关系,Log-Rank检验,表明外周血中未检测到EPCAM+CTCs的患者PFS明显长于存在EPCAM+ CTCs的患者,差异有统计学意义(P= 0.015)。结论1.在HCC的CTCs的检测方面CTC-BIOPSY(?)(A10)检测系统较CTC-BIOPSY(?)(D100)检测系统检出率高、堵管率低,细胞完整、清晰。2.免疫细胞化学双染法标记EPCAM和CD45可有效验证HCC的CTCs,较原有方法对HCC的CTCs定性指导作用凸显。***患者以中老年男性居多,多合并肝炎或肝硬化,就诊时多为进展期,与我国国情总体特点相一致。EPCAM+ CTCs与患者年龄、有无脉管内癌栓具有相关性(P0.05)。4.肝癌患者的生存预后受临床及病理诸多因素影响,具有高度异质性。外周血中存在EPCAM+ CTCs是影响PFS的独立预后因素,且是危险因素。