Calpeptin对丙烯酰胺中毒大鼠微管损伤的干预作用及机制

作     者：苏本玉 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于素芳

授予年度：2019年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：丙烯酰胺 钙蛋白酶 Calpeptin MAP2 微管 

摘      要：丙烯酰胺(acrylamide,ACR)是一种水溶性烯烃,作为化工原料生产聚丙烯酰胺。ACR的神经毒性在人群流行病学研究中得到充分验证。慢性ACR中毒患者的主要临床表现为:手掌多汗蜕皮、四肢麻木、跟腱反射减弱或消失等。在电镜下肿胀的轴突末端微管(microtubules,MT)数量异常,但ACR导致MT损伤的机制不清楚。微管相关蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)中最丰富的是MAP2,MAP2最主要的功能是参与调节MT的组装过程。钙蛋白酶(Calpain)是一类依赖于Ca2+激活的中性半胱氨酸水解酶,它具有水解信号酶、细胞骨架蛋白(MAP2和Tau)和膜蛋白的功能,并且与神经病的发生发展有关。Calpeptin(CP)作为一种人工合成的肽类Calpain抑制剂,具有高效性、特异性及细胞渗透性好等优点,与Calpain的活力位点结合,可逆的抑制Calpain的活力。假设由ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高,MAP2降解有关。目的为了验证ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高和MAP2降解有关这个假设,探索CP对ACR中毒大鼠MT损伤的干预作用及机制,为ACR中毒的预防与治疗提供依据。方法1.动物处理:适应性饲养后将Wistar大鼠随机分为4组(每组10只),分别记为对照组、CP组、ACR组、ACR+CP组。对照组的大鼠腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)给予生理盐水;CP组的大鼠给予CP2000μg/kg(i.p.);ACR和ACR+CP组的大鼠给予ACR30 mg/kg(i.p.),给予ACR 1小时后,ACR+CP组给予CP200μg/kg(i.p.)。ACR隔天染毒,3次/周,共4周。CP隔天干预,早晨和晚上各一次,6次/周,共4周。将ACR溶于0.9%的生理盐水中(浓度为30mg/ml)并以1ml/kg给予大鼠。2.体重及神经行为功能观察:在染毒期间,每周测量体重、后肢撑力、加速转棒试验和步态评分。3.组织形态观察:进行HE染色以在光学显微镜下观察脊髓切片的形态变化。4.免疫组化法分析蛋白表达:应用免疫组织化学方法在光学显微镜下观察m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白在脊髓中的表达。5.免疫印迹法蛋白半定量:应用凝胶电泳和半定量免疫印迹方法,对脊髓中m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白含量进行半定量分析。6.统计方法:所有实验数据以平均值±标准差(X±s)表示。步态评分的数据用Mann-Whitney U test分析,其它的数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析,组间两两比较采用LSD法进行分析。结果1.体重对照组与CP组4周之间基本相似不变;与对照组相比,自第2周开始,ACR组的大鼠体重下降了 5.6%(P0.05)。2.行为学指标(1)后肢撑力:对照组与CP组4周之间基本相似不变;与对照组相比,自第2周开始,ACR组的大鼠后肢展宽增加了 26.9%(P0.05)。与对照组相比,CP组m-calpain含量的变化差别没有统计学意义(P0.05),ACR组的m-calpain含量增加了41.7%(P0.05),ACR组MAP2的含量下降了43.4%(P0.05)。与对照组相比,CP组β-tubulin含量的变化差别没有统计学意义(P0.05),ACR组β-tubulin的含量增加23%(P0.01);与ACR组相比,ACR+CP组β-tubulin的含量降低13.1%(P0.05)。结论1.ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高和MAP2降解有关,这可能是ACR诱导的MT损伤的机制之一。2.CP通过改变calpain和MAP2干预由ACR引起的MT损伤。