角质细胞生长因子-2对油酸致ALI大鼠肺微血管内皮屏障的影响及机制研究

作     者：邵腾皓 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马希刚

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：急性肺损伤 角质细胞生长因子-2 紧密连接 肺微血管内皮屏障 Wnt/β-catenin信号通路 

摘      要：目的本研究通过观察肺微血管内皮屏障改变及相关通路变化,探究角质细胞生长因子-2(KGF-2)对油酸致急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织保护作用及其相关机制。方法1.分组:将45只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为即对照组、ALI组和ALI+KGF-2组。2.处理方式:对照组尾静脉注射生理盐水(NS),尾静脉注射前72小时肺部滴注NS;ALI组尾静脉注射油酸,造模前72小时肺部滴注NS;ALI+KGF-2组尾静脉注射油酸,造模前72小时肺部滴注KGF-2。尾静脉注射油酸复制大鼠ALI模型。3.按分组经过不同处理,8h后处死大鼠,腹主动脉采血,留取肺组织标本,支气管肺泡灌洗液(BALF)。4.观察肺组织损伤改变:(1)大体观察肺组织改变;(2)HE染色行肺组织病理学检查及肺损伤评分评价肺损伤程度;(3)电镜下观察大鼠肺组织超微结构的改变。5.观察肺组织炎症变化及凋亡改变:(1)TUNEL检测肺组织上皮细胞及内皮细胞凋亡情况;(2)ELISA检测因子TNF-a和IL-10水平,评价肺部炎症程度;(3)瑞氏-姬姆萨染色法观察BALF中细胞变化。6.观察肺泡-毛细血管屏障通透性改变:(1)计算大鼠肺组织湿重干重比,评估大鼠肺组织水肿情况;(2)计算大鼠肺组织通透性指数,评估大鼠肺组织蛋白渗漏情况;(3)伊文斯兰实验评估大鼠肺组织肺血管通透性情况。7.观察肺微血管内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin表达变化:(1)免疫组织化学法测定大鼠肺组织Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin的定位及表达;(2)Western blot法检测大鼠肺组织Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin蛋白的表达量;(3)RT-PCR检测Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin mRNA的表达水平。8.观察Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt5a、β-catenin表达变化:(1)免疫组织化学法测定大鼠肺组织Wnt5a、β-catenin的定位及表达;(2)Western blot法检测大鼠肺组织Wnt5a、β-catenin蛋白的表达量。结果:1.肺组织损伤改变:1.1大体观察:对照组大鼠肺组织未见明显异常改变;ALI组大鼠肺组织损伤严重;ALI+KGF-2组大鼠肺组织损伤减轻。1.2.1光镜下观察:对照组肺组织未见明显异常。ALI组中肺组织肺泡间隔增厚,肺泡腔内积聚了大量炎症细胞。而在ALI+KGF-2组中肺组织得到缓解。1.2.2 ALI肺损伤评分(LIS):ALI组的LIS值高于对照组(P0.01),与ALI组相比,ALI+KGF-2组的LIS较低(P0.01),但比对照组LIS高。1.3电镜下观察大鼠肺组织超微结构的改变:对照组大鼠肺组织微血管结构完整。ALI组肺组织细胞损伤严重。ALI+KGF-2组损伤减轻。2.肺组织炎症变化及凋亡改变:2.1观察凋亡:对照组肺组织间散在零星凋亡细胞。ALI组凋亡细胞数明显增多(P0.01)。通过KGF-2干预后,凋亡细胞数有所降低,但仍高于对照组(P0.01)。2.2观察因子TNF-a和IL-10表达水平:与对照组相比,ALI组大鼠肺组织TNF-a表达水平均明显增加(P0.01),IL-10表达水平下降(P0.01);ALI+KGF-2组与ALI组相比,TNF-a表达水平均有所下降(P0.01),IL-10表达水平增加(P0.01)。2.3观察BALF细胞变化:与对照组相比,ALI组BALF中白细胞明显增加,大量红细胞存在;与ALI组相比,ALI+KGF-2组大鼠BALF中白细胞有所减少,红细胞数有所减少;与对照组相比,ALI+KGF-2组大鼠BALF中白细胞有所增多,红细胞数明显增加。3.肺泡-毛细血管屏障通透性改变:各组大鼠肺组织湿干比(W/D)、肺通透性指数(LPI)、伊文斯兰(EB)实验:与对照组相比,ALI组肺W/D比值、LPI值、EB渗出含量明显增加(P0.01);KGF-2预处理后,肺W/D比值、LPI值较ALI模型组明显降低(均P0.01)EB渗出含量有所降低(P0.01);ALI+KGF-2组与对照组相比,肺W/D比值、LPI值、EB渗出含量有所增加(P0.01)。4.肺微血管内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin表达变化:油酸诱导大鼠ALI可降低肺微血管内皮细胞Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin的表达(均P0.01);ALI+KGF-2组预先处理可增加Claudin-5、Zo-1、VE-cadherin的表达(均P0.05)。***/β-catenin信号通路蛋白Wnt5a、β-catenin表达变化:油酸诱导大鼠ALI可增